如何將外源基因在酵母中高表達？

酵母表達系統是廣泛應用于外源基因表達的系統之一，酵母作為基因工程表達系統，既有原核生物那樣生長、繁殖快速和表達量高的特點，又具有與高等真核生物十分相像的蛋白質翻譯后加工和基因表達調控的特征。長期以來酵母作為工業微生物的主要菌種，在工業化發酵方面已經積累了大量的經驗。利用酵母進行重組蛋白生產，只有表達產量和質量都合格才能夠得到應用，酵母對外源基因的表達水平受很多因素的影響：
在基因水平：提高和控制外源基因的轉錄水平是提高表達水平的有效方法之一，所以篩選啟動子就十分重要。另外表達載體在細胞中的拷貝數和穩定性對外源基因在酵母中的表達也有明顯影響。
在蛋白水平：要考慮表達產物的可靠性問題，其中包括外源基因在表達系統中的遺傳穩定性、不同生物來源的基因在酵母中表達后加工和修飾的情況等因素。

當遇到外源重組蛋白的表達產率低，產物無活性或被降解的情況或沒有檢測到蛋白表達，則應該從以下幾個方面進行改進:

1 外源重組蛋白的毒性：
首先確定外源蛋白是否對酵母細胞具有毒性，如果有毒性則選擇誘導表達系統嘗試表達；

2 目的蛋白的降解及穩定性：
重組蛋白的穩定性是提高蛋白表達量的一個重要因素，如果在表達中有蛋白質降解現象，即使采用高密度培養酵母以提高發酵液中的蛋白含量，但由于相應的蛋白酶的含量也隨之增加，目的蛋白的積累會受到嚴重影響，所以細胞中蛋白酶的水平決定目的蛋白的最終產量。為了提高目的蛋白的表達產率，可以采用以下策略:
(a)選擇蛋白酶缺陷的菌株，避免表達產物的降解，提高目的蛋白的積累量；
(b)在培養基中添加富含氨基酸的組分和酪蛋白的水解物，胃蛋白的水解物，降低對目的蛋白的水解速度；
(c)采用非緩沖體系的培養基，通過pH的改變降低蛋白酶的活性，減少對表達產物的降解量。

3 信號肽的選擇：
分泌表達重組蛋白是一種獲得目的產物的理想方法，因為它一方面可以簡化后期的分離純化工藝，另一方面可減輕細胞的負荷，提高細胞生產蛋白的能力。還可以減少蛋白酶對目的蛋白的水解機會。研究者將釀酒酵母的α-因子信號肽的前信號序列融合到人腫瘤抑制因子P53的cDNA區在畢赤酵母中構建MUTs，發現其對人腫瘤抑制因子P53 的表達量比傳統中使用的S.cerevisiaeyP3的表達量高。YuMingrui在畢赤酵母中表達來源于Yarrowia lipoytica的Lip2 酯酶時，通過導入釀酒酵母α-因子信號肽，實現了目的蛋白的表達。但信號肽如果選擇不佳，會使蛋白質分泌量少或者沒有進行分泌表達。

4使用多拷貝序列:
外源基因在酵母表達系統中的拷貝數影響外源基因的表達水平， 一般來說整合的拷貝數越多，蛋白的表達量越大。如鼠的表皮生長因子(EGF)、人腫瘤壞死因子(TNF)。目前常用提高外源基因整合拷貝數的方法是a)通過不同的轉化方法提高整合拷貝數；b)在體外載體上多次插入目的基因片斷；c)將載體中的基因兩端連上來自宿主或其他非必需高重復的基因片斷，通過同源重組而達到高拷貝整合的目的。

5提高發酵水平:
酵母表達系統是一類真核生物表達系統，它能使表達產物糖基化，其細胞的組分和代謝產物對人體無毒，而且還可以在簡單又廉價的培養基上生長并達到高細胞濃度，因此酵母表達系統一直是進行重組蛋白發酵生產的選擇。通過選擇發酵參數，如溫度、時間、pH、通氣量等，和改善培養基的組成，優化發酵工藝、提高發酵產率。甲醇可以誘導AOX啟動子驅動重組蛋白表達，也可誘導蛋白酶的表達，而用于培養的碳源甘油對AOX啟動子有抑制作用。所以在利用甲醇誘導外源蛋白表達時，要注意甘油和甲醇的加入量。甘油的添加量應該在誘導時被消耗盡，而甘油的添加量取決于培養條件和轉化子。

6檢查是否有提前終止轉錄發生：
如果有則要考慮目的基因序列中的AT含量，進行序列的優化；例如序列中含有TTTTTATA，類似于HIV-1 gp120 基因的ATTATTTTATAAA,會出現提前終止轉錄。（還有一種情況就是克隆構建的時候因為移碼等原因導致的表達提前）

7表達產物的糖基化：
酵母表達體系有時候會使表達產物過糖基化影響表達產物的活性。可嘗試進行胞內表達， 不通過分泌表達則蛋白質不會被修飾；或者采用N-GlycosidaseF對蛋白質進行去糖基化；也可以改造基因去除N-糖基化位點(Asn-XSer/Thr)。

Over-expression of Trimastix proteins in yeast. The over-expression of GFP tagged proteins of Trimastix in Saccharomyces cerevisiae . The columns represent the signals from GFP tag (green), MitoTracker (red), merged GFP and MitoTracker and DIC. Rows represent individual proteins: cpn60, P1-protein of GCS, H-protein of GCS and H-protein of GCS truncated of the first 16 amino acids. doi:10.1371/journal.pone.0055417.g001 

synuclein aggregate formation upon high copy expression in yeast. Live-cell fluorescence microscopy of yeast cells expressing ? -synuclein-KLID-GFP from high copy plasmids was compared with immunofluorescence of untagged ? -synucleins. Yeast cells pre-grown to mid-log phase were induced in galactose-containing medium and examined for aggregates at 8 h of induction. GFP-expressing cells were used as control. Aggregate formation of untagged WT, A30P, and A53T ? -synuclein was visualized by immunofluorescence. N-terminal eGFP-tagged ? -synuclein via SAAAG linker and ? -synuclein C-terminally fused to myeGFP was employed for further comparison. White arrows point at intracellular inclusions.