綠色熒光蛋白之光--生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)的改革與探索
生物技術(shù)(biotechnology)是以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，以基因工程為核心，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的。同時(shí)，生物技術(shù)也是一門綜合性和實(shí)踐性很強(qiáng)的學(xué)科。綜合大實(shí)驗(yàn)是培養(yǎng)學(xué)生在掌握一定的基礎(chǔ)知識和基本技能的基礎(chǔ)上，綜合運(yùn)用各學(xué)科的理論知識和實(shí)驗(yàn)技能解決實(shí)際問題能力的實(shí)踐過程。西北農(nóng)林科技大學(xué)生命學(xué)院生化與分子生物學(xué)教研室為本院三年級本科生，在先修生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程等專業(yè)課程的基礎(chǔ)上，開設(shè)了以水母綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的原核表達(dá)、分離、純化和鑒定為主要內(nèi)容的生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過不斷的實(shí)踐和探索，我校生命科學(xué)學(xué)院在綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)踐教學(xué)上取得了良好的教學(xué)效果。現(xiàn)將我們在教學(xué)過程中的體會與同行加以交流，以期拋磚引玉。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
綜合性實(shí)驗(yàn)指的是實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涉及綜合知識及方法、手段對學(xué)生理論知識、實(shí)踐能力及思維方式所進(jìn)行的聯(lián)合培養(yǎng)。眾多的教學(xué)研究實(shí)踐證明，綜合性實(shí)驗(yàn)是培養(yǎng)學(xué)生良好專業(yè)技能的有效手段[2]。但如何在有限的教學(xué)學(xué)時(shí)完成基本技能的訓(xùn)練和培養(yǎng)學(xué)生的綜合科研能力，是教學(xué)設(shè)計(jì)的難點(diǎn)之一。在蛋白質(zhì)純化中，多個(gè)步驟存在大量的重復(fù)性檢測工作，使學(xué)時(shí)的有效性大大降低。為此，把科研中成熟的先進(jìn)方法和技術(shù)充實(shí)到實(shí)驗(yàn)教學(xué)中很有必要。GFP被稱為21世紀(jì)的顯微鏡，當(dāng)它受到藍(lán)光照射時(shí)，會吸收藍(lán)光的部分能量發(fā)射出明亮綠色的熒光。GFP熒光是生物細(xì)胞的自主功能，不需要任何外源反應(yīng)底物即可產(chǎn)生，作為標(biāo)記物在細(xì)胞內(nèi)可穩(wěn)定表達(dá)并易于觀察和檢測(LUYOR-3410高強(qiáng)度紫外燈下就可以觀察)。其直觀的特點(diǎn)可有效克服重復(fù)純化檢測步驟與學(xué)時(shí)的矛盾。生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)以GFP為純化目標(biāo)，在傳統(tǒng)純化手段訓(xùn)練的同時(shí)，結(jié)合標(biāo)簽融合技術(shù)的設(shè)計(jì)，有效對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果讓學(xué)生體會技術(shù)進(jìn)展對蛋白質(zhì)純化的推進(jìn)作用。

2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)的目的對本科生來說主要體現(xiàn)在四個(gè)方面：
(1)鞏固前期所學(xué)理論知識。生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容要緊密結(jié)合本科生前期學(xué)習(xí)的生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程、酶工程等專業(yè)科目，培養(yǎng)理論基礎(chǔ)扎實(shí)，動手能力較強(qiáng)的創(chuàng)新型人才，加深學(xué)生對生物技術(shù)知識體系的認(rèn)識；
(2)綜合掌握各項(xiàng)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)的基本技能。綜合大實(shí)驗(yàn)內(nèi)容設(shè)計(jì)上拋棄了以前分散的、孤立的單純學(xué)習(xí)某一實(shí)驗(yàn)技術(shù)的缺陷，將單個(gè)實(shí)驗(yàn)綜合為系統(tǒng)的、連貫的系列型基本生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)，涉及質(zhì)粒提取、感受態(tài)細(xì)胞制備、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、陽性克隆鑒定、擴(kuò)大培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)、表達(dá)蛋白的提取、鹽析、疏水層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析、透析及聚丙烯酰胺凝膠電泳等多種技術(shù)，使學(xué)生接受多種生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)基本技能的訓(xùn)練；
(3)提高發(fā)現(xiàn)問題和解決問題的能力。系統(tǒng)性和連貫性是綜合大實(shí)驗(yàn)的基本特征，前一部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果即為后一部分的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。前面實(shí)驗(yàn)的結(jié)果對后面實(shí)驗(yàn)的開展及實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果都具有很大的影響。因此，學(xué)生必須積極主動地關(guān)注實(shí)驗(yàn)的整個(gè)過程，對實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問題要認(rèn)真分析，找出原因，從而提高分析問題和解決問題的能力；
(4)在學(xué)習(xí)基本知識和基本實(shí)驗(yàn)技能的同時(shí)，關(guān)注學(xué)科前沿技術(shù)，體會新技術(shù)發(fā)展對科學(xué)發(fā)展的推動作用。

3 實(shí)驗(yàn)具體內(nèi)容及技術(shù)路線
為了實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的目標(biāo)，我們安排了以下九個(gè)分實(shí)驗(yàn)：
實(shí)驗(yàn)一 細(xì)菌培養(yǎng)；
實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒提取及感受態(tài)細(xì)胞制備；
實(shí)驗(yàn)三 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達(dá)；
實(shí)驗(yàn)四 硫酸銨沉淀純化GFP；
實(shí)驗(yàn)五 疏水層析純化GFP；
實(shí)驗(yàn)六 離子交換層析純化GFP；
實(shí)驗(yàn)七 凝膠過濾層析純化GFP；
實(shí)驗(yàn)八 親和層析純化GFP；
實(shí)驗(yàn)九 純化GFP的SDS-PAGE分析。

4 實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備
4.1 使學(xué)生熟悉實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)相關(guān)技術(shù)的基本知識
生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)課程內(nèi)容涉及面廣，需要實(shí)驗(yàn)室老師和實(shí)驗(yàn)課程指導(dǎo)教師以及學(xué)生之間的密切配合，才能達(dá)到預(yù)期目的。對于實(shí)驗(yàn)室老師來說，需要準(zhǔn)備好綜合大實(shí)驗(yàn)所必需的各種儀器設(shè)備、試劑和耗材，并使各種儀器設(shè)備達(dá)到良好的使用狀態(tài)；實(shí)驗(yàn)課程指導(dǎo)教師不僅要與實(shí)驗(yàn)室老師配合做好各項(xiàng)準(zhǔn)備工作，而且要熟悉各種儀器的操作規(guī)程，更重要的是指導(dǎo)學(xué)生做好實(shí)驗(yàn)前期的準(zhǔn)備工作；實(shí)驗(yàn)實(shí)施前一月指導(dǎo)教師要與自己所代班級學(xué)習(xí)委員提前聯(lián)系，讓學(xué)生認(rèn)真自學(xué)本校郭藹光老師主編的“生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)”部分(理論部分)中生物大分子的分離制備、離心技術(shù)、層析技術(shù)和電泳技術(shù)的基本知識，使學(xué)生熟悉生物大分子制備前的處理、生物大分子的提取和生物大分子分離純化的常用方法和技術(shù)[5]。同時(shí)，使學(xué)生熟悉綜合大實(shí)驗(yàn)的目的和具體內(nèi)容，并結(jié)合學(xué)過的相關(guān)知識，查閱文獻(xiàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和提供的條件提出實(shí)驗(yàn)方案，對實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行討論和優(yōu)化，提交指導(dǎo)教師審閱。

4.2 加強(qiáng)學(xué)生科學(xué)精神和科學(xué)思維的培養(yǎng)
GFP是1962年下村修在美國西北海岸所盛產(chǎn)的水母中所發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)。GFP分子由238個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，11個(gè)β-折疊，形狀呈圓柱形，第65-67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成發(fā)光團(tuán)，是一種全新的非酶性報(bào)告基因，已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)表達(dá)純化、蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)細(xì)胞內(nèi)定位示蹤和模式生物轉(zhuǎn)基因等生物學(xué)研究中[6-8]。日本科學(xué)家下村修(Osamu Shimomura)、美國科學(xué)家馬丁·沙爾菲(Martin Chalfie)和美籍華裔科學(xué)家錢永健(RogerY. Tsien)，以其在GFP的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展中所做出的杰出貢獻(xiàn)，而共同獲得了2008年的諾貝爾化學(xué)獎[9]。因此，在實(shí)驗(yàn)過程中把學(xué)生對GFP發(fā)現(xiàn)發(fā)展的歷史，及其在生物研究中的相關(guān)應(yīng)用的學(xué)習(xí)和理解作為一項(xiàng)重要內(nèi)容很有必要。不但能使學(xué)生了解GFP的前世與今生，更為重要的是使學(xué)生從中學(xué)習(xí)和領(lǐng)悟科學(xué)家的科學(xué)精神和科學(xué)的思維方式，并融入到自己的學(xué)習(xí)實(shí)踐中，提高其創(chuàng)新能力。為此，我們實(shí)驗(yàn)實(shí)施前兩周向?qū)W生推薦周程“諾貝爾獎級的科學(xué)成就究竟是怎樣取得的?——綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)、表達(dá)與開發(fā)”和“杰出人才是怎樣煉成的？——下村修榮獲諾貝爾化學(xué)獎案例研究”、張國增等“下村修科研歷程的啟示”和馬三梅等“從綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)談如何提出新穎的科研問題”等文章[10-13]，要求學(xué)生認(rèn)真學(xué)習(xí)寫閱讀筆記和讀后感想。實(shí)驗(yàn)前教師進(jìn)行檢查和提問，使學(xué)生詳細(xì)地了解GFP分子的發(fā)現(xiàn)、GFP基因的分離與復(fù)制、GFP基因的表達(dá)、GFP突變體的開發(fā)、GFP類似物的篩選與改進(jìn)的歷史進(jìn)程，了解三位科學(xué)家的學(xué)術(shù)貢獻(xiàn)以及加深對GFP的理解，學(xué)習(xí)GFP發(fā)現(xiàn)過程中是如何提出問題以及提出問題所用的思維方式。啟發(fā)學(xué)生運(yùn)用求異和置換的思維方式來提出新穎的科研問題，并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來回答提出的問題，從而為學(xué)生完成綜合大實(shí)驗(yàn)奠定良好的基礎(chǔ)。例如，一位同學(xué)在讀后感中這樣說：“在閱讀完文獻(xiàn)之后，給我印象深刻的是科學(xué)家們在科研道路上所展現(xiàn)的專業(yè)精神、奉獻(xiàn)精神，這一切的背后都是源于他們對生命的熱愛和激情，以及他們探索真理所帶有的強(qiáng)烈使命感。GFP的發(fā)現(xiàn)、表達(dá)與開發(fā)的過程說明，你得有一顆耐得住寂寞，一絲不茍，善于觀察，細(xì)心發(fā)現(xiàn)，敢于追根究底的心。在不斷失敗中依然不氣餒，不認(rèn)輸，鍥而不舍的精神。當(dāng)然，縝密的邏輯思維，過硬的專業(yè)基礎(chǔ)，從不停止的創(chuàng)新意識也是必不可少的。在以后的學(xué)習(xí)和科研道路上，我會時(shí)刻提醒自己做到以上幾點(diǎn)，同時(shí)，保持一顆年輕跳動永不麻木的心。”另一位同學(xué)在讀后感中這樣說：“科學(xué)研究中重要的是提出問題，在實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)一個(gè)現(xiàn)象時(shí)，要想為什么會出現(xiàn)這種現(xiàn)象，通過這種現(xiàn)象又能提出什么新的問題。GFP發(fā)現(xiàn)過程中，提出問題所運(yùn)用求異和置換的思維方式，對于即將步入實(shí)驗(yàn)室工作的我們，有著很好的啟發(fā)作用。”

5 實(shí)驗(yàn)實(shí)施過程
5.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排
生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)，通常安排在每年春季學(xué)期的后半學(xué)期，實(shí)驗(yàn)周期2周。

5.2 充分發(fā)揮學(xué)生的積極性和主動性
綜合大實(shí)驗(yàn)與常規(guī)本科實(shí)驗(yàn)不同，具有系統(tǒng)性、連續(xù)性和協(xié)作性，在實(shí)驗(yàn)過程中，把班級分若干個(gè)實(shí)驗(yàn)小組(4人一組)，并選出1名小組組長，負(fù)責(zé)召集本組同學(xué)對實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行討論，明確組員的分工。鼓勵學(xué)生根據(jù)提供的實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備，依據(jù)所學(xué)的基本知識和理論，提出合理可行的實(shí)驗(yàn)方案。例如在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化中，既可采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法，也可采用電擊轉(zhuǎn)化法。在化學(xué)轉(zhuǎn)化法中，可選擇傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法或快速的轉(zhuǎn)化方法。在GFP分離純化時(shí)，有些組選擇陽離子交換，而有些組選擇陰離子交換。有些組選擇線性梯度洗脫，而有些組選擇階段式洗脫[14]。在實(shí)驗(yàn)中GFP需要經(jīng)過疏水、離子交換、親和層析和凝膠過濾四次層析純化，學(xué)生針對自己的樣品進(jìn)行自主操作[15]。對實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問題，要求學(xué)生積極思考，查閱相關(guān)資料，進(jìn)行組內(nèi)討論，分析原因，提出解決方法。金屬螯合親和層析是近年來出現(xiàn)的一種新型親和層析技術(shù)。相對于傳統(tǒng)的分離蛋白質(zhì)技術(shù)，如凝膠過濾層析、吸附層析、離子交換層析等，親和層析的更大特點(diǎn)是和簡便，其通常只需經(jīng)過一次處理即可快速、簡便地使目標(biāo)蛋白質(zhì)從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來，而且純度很高。通過親和層析和傳統(tǒng)分離蛋白質(zhì)技術(shù)的比較，學(xué)生可親身體驗(yàn)到新技術(shù)對分離蛋白質(zhì)的巨大優(yōu)勢。例如一位同學(xué)在實(shí)驗(yàn)報(bào)告的總結(jié)中這樣說：“本次實(shí)驗(yàn)以GFP為材料，使我們在實(shí)驗(yàn)過程中直觀地觀察到實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程，通過對GFP的提取、分離、純化和鑒定等一系列過程，深入了解了如何對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和純化，鞏固了相關(guān)理論知識，提高了實(shí)驗(yàn)技能，同時(shí)也感受到了團(tuán)隊(duì)合作的和共享。”
5.3 規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作，認(rèn)真做好實(shí)驗(yàn)總結(jié)
先前的單項(xiàng)實(shí)驗(yàn)大多是教師首先給學(xué)生講授實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)步驟和注意事項(xiàng)，然后學(xué)生“照方抓藥”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，學(xué)生往往只知其然，不知其所以然。雖然之前學(xué)生也做過不少化學(xué)和生物化學(xué)等實(shí)驗(yàn)，但是還有許多學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作不規(guī)范，普遍和典型的一個(gè)現(xiàn)象就是用完移液管后隨意放在實(shí)驗(yàn)臺面上，而不是放在移液管架上。在實(shí)驗(yàn)過程中，對學(xué)生不規(guī)范的實(shí)驗(yàn)操作，教師要及時(shí)指出并予以糾正。例如，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，都要用LUYOR-3410高強(qiáng)度紫外線燈監(jiān)測GFP，了解其在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中的變化；在細(xì)菌培養(yǎng)、感受態(tài)細(xì)胞制備、擴(kuò)大培養(yǎng)過程中要嚴(yán)格無菌操作，防止污染；層析柱的填充要均勻，不能分層，柱子中不能有氣泡，否則要重新裝住。平衡和洗脫時(shí)，必須保持柱材濕潤，不能干柱或裂縫，否則分離純化將前功盡棄；四次柱層析實(shí)驗(yàn)中柱材料一定要嚴(yán)格區(qū)分不能相互混用，否則柱子將失效。許多同學(xué)在實(shí)驗(yàn)報(bào)告的總結(jié)中都談到，綜合大實(shí)驗(yàn)使自己體會到，做任何實(shí)驗(yàn)都必須清楚每一步在做什么，為什么這么做。
實(shí)驗(yàn)報(bào)告是綜合大實(shí)驗(yàn)課程的重要環(huán)節(jié)，重點(diǎn)考查學(xué)生應(yīng)用已學(xué)習(xí)的基本理論和知識，對實(shí)驗(yàn)思路、實(shí)驗(yàn)結(jié)果、實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)等做出綜合性的系統(tǒng)的總結(jié)和分析，提高學(xué)生分析問題和解決問題的能力[16]。要求學(xué)生按照論文格式完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告，包括以下幾部分：封面、正文(文獻(xiàn)綜述、實(shí)驗(yàn)部分)、參考文獻(xiàn)、附錄(實(shí)驗(yàn)的原始數(shù)據(jù))。對實(shí)驗(yàn)中的異常現(xiàn)象，要依據(jù)所學(xué)的基本知識和理論進(jìn)行細(xì)致分析，找出原因，并提出改進(jìn)意見。

6 考核方式
建立以提高學(xué)生素質(zhì)為目標(biāo)的考核體系，對于調(diào)動學(xué)生參加生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)的積極性和主動性具有重要的導(dǎo)向作用。為此，我們建立了以平時(shí)成績(實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)記錄、閱讀筆記和實(shí)驗(yàn)課前提問) 、實(shí)驗(yàn)成績(實(shí)驗(yàn)中操作規(guī)范、參與程度和實(shí)驗(yàn)報(bào)告)作為學(xué)生綜合大實(shí)驗(yàn)課程的最終成績(平時(shí)成績30%、實(shí)驗(yàn)成績70%)。這就督促學(xué)生在綜合大實(shí)驗(yàn)的前期準(zhǔn)備和實(shí)驗(yàn)過程以及實(shí)驗(yàn)報(bào)告的各個(gè)環(huán)節(jié)充分發(fā)揮自己的主觀能動性，積極認(rèn)真地參與到綜合大實(shí)驗(yàn)的全過程，通過自己的親身實(shí)踐體會科學(xué)研究的艱辛和喜悅，提升自己的科學(xué)素養(yǎng)和創(chuàng)新能力。例如，2013級生物技術(shù)專業(yè)2班33名學(xué)生考核結(jié)果中，總分85分6名(18.2%)，88分4名(12.1%)，90分12名(36.4%)，92分2名(6.1%)，95分9名(27.3%)。課程從2005年開始實(shí)施，至今已有12年之久，歷經(jīng)過數(shù)輪的課程改革，學(xué)生從最初的本院生物技術(shù)專業(yè)擴(kuò)展到生物科學(xué)專業(yè)，從生命學(xué)院延伸到本校創(chuàng)新學(xué)院。學(xué)生評價(jià)生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)課，內(nèi)容系統(tǒng)完整，理論知識通過實(shí)驗(yàn)得到了強(qiáng)化，開闊了眼界，拓展了知識，培養(yǎng)了科學(xué)思維和科學(xué)精神，大大提高了動手能力及分析和解決問題的能力等綜合素質(zhì)。總之，多年的教學(xué)實(shí)踐證明，生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)使學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作技能、團(tuán)結(jié)合作的精神、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度、分析問題和解決問題的能力，都得到了很好的訓(xùn)練和提高，是提高學(xué)生綜合素質(zhì)和創(chuàng)新能力的有效途徑。

 文章作者：李科友*，武永軍，劉林麗，劉晶瑩，陳 鵬*楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 712100