熒光蛋白選擇需要考慮的幾個問題

熒光蛋白用于單色實驗

對于單色實驗，綠色熒光蛋白是最常用的。EGFP是更受歡迎的綠色熒光蛋白，是許多單色研究的理想選擇。然而，其他綠色熒光蛋白，如TurboGFP（又名maxGFP），對于某些應用可能是一種更好的選擇。TurboGFP比EGFP具有更優越的功能，如更明亮的綠色熒光，成熟速度更快，對高pH值和光穩定性耐受更強，這些使其成為早期信號檢測和高靈敏度實驗的理想選擇。如果是紅色熒光蛋白，mCherry則由于其單體結構，良好的熒光性質和低毒性等特點使其成為大多數實驗的選擇，它特別適用于蛋白標記或者當細胞中其他紅色熒光蛋白發生細胞毒性或蛋白聚集時。在熒光蛋白發生二聚化和聚集的情況下，dTomato依然可以發出很亮的熒光。DsRed_Express2是另一個紅色熒光蛋白的理想選擇，它是具有最小細胞毒性的紅色熒光蛋白。

熒光蛋白用于多色實驗

對于同時使用多個熒光基團的實驗（包括熒光蛋白和其他染料如DAPI），研究人員必須仔細考慮熒光基團的光譜性質，以確保激發光和發射光可以在顯微鏡、流式細胞儀或其他熒光檢測設備的濾光片上可以進行觀察區分。通常情況下，熒光檢測設備應該能夠讀出每種熒光的熒光信號，而相互不干擾。通過使用激發濾光片來激發目的熒光基團產生合適頻率的激發光，使用發射濾片控制目的熒光基團的發射熒光進入熒光檢測器。對于兩種顏色，標準綠色熒光蛋白如EGFP加上標準紅色熒光蛋白如mCherry幾乎在所有熒光顯微鏡和流式細胞儀上都能正常工作。對于三種顏色，藍色、綠色和紅色熒光蛋白組合（如TagBFP + EGFP + mCherry）或青色、黃色和紅色組合（例如CyPet + YPet + mCherry）可以很好的一起配合工作，因為這些組合在大多數熒光顯微鏡或流式細胞儀上易于分辨觀察。

熒光共振能量轉移（FRET）
熒光蛋白廣泛應用于基于熒光共振能量轉移（FRET）的實驗中。FRET是一種物理過程，在此期間，受激發供體發色基團分子通過非放射性偶極間耦合將能量轉移到受體發色基團。FRET會導致供體熒光強度衰減，而受體發射熒光增加。FRET需要一些前提條件：供體和受體必須很接近（10-100?）；受體的吸收光譜必須與供體的發射光譜重疊；供體和受體的躍遷偶極方向必須是平行的。FRET是距離依賴型的，且FRET的效率與供體和受體之間距離的六次方成反比。因此，它對于距離的微小變化非常敏感，使其成為許多研究應用的強大的工具，如研究DNA或蛋白質結構，研究分子間相互作用等。青—黃色供體/受體對CyPet-YPet常用于FRET實驗。

熒光蛋白選擇方案：

單熒光：EGFP，TurboGFP，mCherry，dTomato或DsRed_Express2（這些熒光蛋白可以跟DAPI一起使用）
雙熒光：EGFP + mCherry或TurboGFP + mCherry （這些組合可以跟DAPI一起使用）
三熒光：TagBFP + EGFP + mCherry或CyPet + YPet + mCherry （如果使用合適的濾片，第二種組合可以跟DAPI一起使用）
FRET-based應用：CyPet - YPet

熒光蛋白表達為什么這么弱？

低到中等程度的抗性基因表達就能讓細胞獲得對藥物的抗性。相反，熒光蛋白（FP）則需要高水平的表達才能獲得明亮的熒光信號，較低或者中等程度的熒光表達會產生較弱的熒光信號，甚至會低于設備檢測的更低臨界值。此外，某些熒光蛋白（如EBFP）比常用熒光蛋白（如EGFP）更暗淡，特別難以檢測。一些研究人員不得不使用抗熒光蛋白抗體，以可視化體外細胞培養或體內的熒光蛋白。以下是導致熒光不良的最常見原因：

弱啟動子驅動熒光蛋白的表達
有一些啟動子本身就比較弱（如UBC），只能驅動熒光蛋白的弱表達。有的啟動子（如CMV）可以在體外細胞培養中很好地起作用，但有時在體內會沉默。當表達熒光蛋白時，您應該盡可能嘗試使用一個強的廣泛性啟動子（如EF1A或CAG）。如果您必須使用組織特異性啟動子，請盡可能選擇一個表達能力強的；如果您必須使用弱或很弱的啟動子，請為熒光蛋白信號不足的可能性做好準備。當這種情況發生時，這并不意味著您的熒光蛋白沒有表達，它可能只是表達量不高。您可以使用更靈敏的檢測方法，如RT-PCR或免疫熒光進行檢測。

在慢病毒和MMLV載體中表達熒光蛋白
對于逆轉錄病毒載體系統（慢病毒或者MMLV），聚腺苷酸化信號（poly A）不能存在于LTR之間，因為這會抑制病毒的包裝。多聚腺苷酸化信號存在于3'LTR中，來自上游啟動子的轉錄會經過上游ORF的末尾繼續往下游的啟動子和ORF轉錄，這會導致下游ORF的表達部分受到抑制。當下游ORF為熒光蛋白時，其表達會大大減少。您可以采取如下措施提高熒光蛋白的表達：
?使用不同的載體系統，比如使用常規載體，腺病毒載體或腺相關病毒載體
?使用熒光更強的熒光蛋白變體（如TurboGFP代替EGFP）
?如果考慮在多順反子的上游表達盒表達熒光蛋白，您可以使用2A linker連接目的基因和熒光蛋白基因。然而，這可能會影響多順反子中其他ORF的生物學功能，也可能導致熒光蛋白表達較弱（見下文），且會增加載體構建的成本和時間。

在多順反子中表達熒光蛋白
當在多順反子中表達熒光蛋白基因時，通常會存在以下所述問題，且有時熒光蛋白基因的表達與上游下游ORF有關。
?熒光蛋白基因在IRES的下游
在包含一個或多個IRES元件的多順反子中，與上游ORF相比，下游ORF表達水平比較低（通常為上游的10%-20%）。如果一個熒光蛋白在IRES的下游表達，則熒光會較弱。如果您必須在多順反子的下游表達熒光蛋白，您可以考慮使用2A肽（如P2A或T2A），而不是IRES。通過使用2A肽，多順反子下游ORF通常與上游ORF的表達量相當（或稍微低一點）。然而，2A肽也有缺陷，如可能會影響靶基因（GOI）的功能。當存在多個2A肽時，下游ORF傾向于以較低水平表達。另外，2A肽的自我切割并不是100％有效的，其效率會受上下游ORF序列的影響。因此，不能進行有效自我切割的融合蛋白將會是一種翻譯產物，在某些實驗運用中，這是一個值得注意的問題。需要特別注意的是2A肽的切割會在上游蛋白的C末端留下額外的短肽，并在下游蛋白的N末端留下額外的脯氨酸。在大多數實驗應用中，這種情況不會產生不良影響，但是在某些情況下可能會影響蛋白功能。

?熒光蛋白是融合蛋白的一部分
融合蛋白幾乎總是表現出比未融合蛋白較弱的熒光（比如EGFP/Neo融合蛋白的熒光比單獨的EGFP熒光更弱）。此外，未經測試的融合蛋白可能存在胞內不穩定，錯誤折疊或無功能等問題。如果您懷疑這些是熒光弱的原因，可以嘗試以下操作：

?使用更強的啟動子（例如EF1A）來驅動融合基因的表達
?以非融合形式表達熒光蛋白
?使用更亮的熒光蛋白變體（如TurboGFP代替EGFP）
?增加一個linker，或者使用不同的linker來連接熒光蛋白和目的基因
?調換熒光蛋白和目的基因的位置

熒光蛋白本身亮度低
一些熒光蛋白本身比同一顏色家族的其它種類熒光更暗。例如在藍色家族中，EBFP的亮度僅為TagBFP亮度的三分之一。

熒光蛋白，熒光素酶哪個好？

熒光蛋白，螢光素酶都是基于重組蛋白的報告基因，可以用于定位或成像研究。然而，這幾類蛋白各有不同，適用于不同的實驗設計。熒光蛋白和螢光素酶都屬于發光蛋白，可用照相機或類似的裝置來檢測熒光表達。熒光蛋白通過吸收一種顏色的光（激發），然后發出不同顏色（發射）的較低能量光來起作用。相反，螢光素酶（和其他生物發光酶）通過催化底物（即螢光素）發生化學反應而發光。
熒光蛋白比螢光素酶明亮得多，這有利于將其應用到許多不同類型的實驗中。但是，在組織樣品或活體動物中，背景、自發熒光和光散射等問題可能會影響熒光的觀察。熒光素酶的活性分析需要螢光素，所以在分析之前必須將該底物加入培養基或注射到活體動物體內。與熒光蛋白相比，這可能會影響實驗的重復性或定量。

熒光蛋白選擇時需要考慮哪些參數？

激發波長/發射波長：每一種熒光蛋白都有其獨特的激發波長和發射波長，因此，選擇的熒光蛋白必須是使用的系統能夠激發和檢測到的。比如，使用的顯微鏡只有兩個激發器，488 nm和561 nm，那就不能夠選擇遠紅外熒光蛋白。又比如，使用超過一個熒光蛋白時，必須確保他們的發射波長沒有重疊。
寡聚反應：代熒光蛋白易于寡聚化，當和目的基因融合表達時，可能會影響目的基因蛋白的生物學功能。因此建議使用單體的熒光蛋白，比如mCherry。
氧氣：許多熒光蛋白的成熟需要氧氣，特別是衍生自GFP的熒光蛋白，如果這些熒光蛋白處于缺氧環境，可能就觀察不到熒光。
成熟時間：成熟時間是熒光蛋白正確折疊和產生發色團所需的時間。時間可能是幾分鐘到幾小時，superfolder GFP (sfGFP)和mNeonGFP在37 °C所需時間小于10min；mCherry 大概需要15 min；TagRFP 大概需要100 min；DsRed 大概需要10 hours。
溫度：溫度會影響熒光蛋白的成熟時間和熒光強度，比如EGFP適合37 °C，所以EGFP最適合哺乳動物或者細菌的研究，而GFPS65T相對適合酵母的研究。
亮度：熒光蛋白的亮度值由消光系數與量子產率的乘積計算得出。在許多情況下，將熒光蛋白的亮度與EGFP(設定為1)進行比較，有一些熒光蛋白非常暗淡（例如TagRFP657，其具有亮度只有0.1），因此亮度也需要考慮。
耐光性：長時間暴露在激發光下，熒光分子被漂白（即失去發光能力）。光穩定性可短至100毫秒（如EBFP）或長達1小時（如mAmetrine1.2）。但是，對于大多數熒光蛋白來說，它只需幾秒鐘到幾分鐘。另外，光穩定性可能也會受實驗參數影響，例如激發光強度，pH或溫度等。
pH穩定性：如果計劃在酸性環境中表達熒光蛋白，則此參數非常重要，一些熒光蛋白具有不同的ex/em光譜（例如mKeima）或在pH變化時熒光強度會發生改變（例如pHluorin，pHTomato）。

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