轉基因和基因編輯豬的研究進展
李國玲 792268184@qq.com, 徐志謙 , 楊化強 , 吳珍芳 通信作者wzfemail@163.com   
豬作為重要的農業經濟動物是人類肉類產品的主要來源，同時豬在遺傳背景、解剖學、生理病理學、營養代謝和疾病特征等方面與人類高度相似，因此也成為生物醫學研究中的重要模式生物[1-3]。轉基因和基因編輯豬的研究對豬農業生產性狀的改良和特定性狀的培育，以及人類疾病發生機制、病理毒理研究、治療藥物評估等方面具有重要的應用價值。隨著鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFN)、類轉錄啟動因子效應物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALEN)和規律性重復短回文序列簇(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas endonucleases 9，CRISPR/Cas9)等基因編輯技術的出現[4-8]，其突破了傳統分子標記輔助選擇和數量性狀位點等的技術障礙，實現了基因組的修飾，大幅提高和改良了豬生產性狀；同時也在動物生物反應器、人類疾病模型、異種器官移植等生物醫學領域的發展發揮了重要作用。本文將結合當前我國轉基因及基因編輯豬的研究現狀，對其在農業生產性狀改良如提高產肉量、改善肉質、提高抗病能力和建立動物生物反應器，模擬人類疾病，應用于異種器官移植等方面進行綜述。

1 我國轉基因和基因編輯豬的研究現狀
本文利用中國知網(CNKI)、Web of Science、知識產權局三大平臺，采用“轉基因”、“基因編輯”、“豬”等相關轉基因技術和基因編輯技術豬制備等一系列專有名詞，對“十一五”之后國內外的轉基因豬的文獻和進行檢索。在CNKI數據庫中，截止至2019年3月，共有166篇關于轉基因或基因編輯豬制備及其表型分析、應用的中文研究性論文發表，其中“十一五”期間25篇、“十二五”期間76篇、“十三五”期間68篇。研究機構分布以吉林大學、中國農業大學、中國農業科學院北京畜牲獸醫研究所和湖北省農業科學院畜牲獸醫研究所最為突出。在Web of Science數據庫中，共檢索到332篇關于轉基因豬制備、表型分析及應用的英文論文，其中中國131篇、美國95篇、德國、日本和韓國均為34篇；在中國轉基因或基因編輯豬相關英文論文中，“十一五”發表8篇(占全球相關文獻17.78%)、“十二五”發表52篇(占全球相關文獻37.68%)、“十三五”發表71篇(占全球相關文獻47.65%)，單位以中國農業大學、中國農業科學院和中國科學院貢獻更大。在知識產權局數據庫中，共檢索到281項國內外轉基因或基因編輯豬制備的，其中在美國申請的99項、在中國申請的67項，在韓國申請的46項。在中國申請的中，“十一五”期間有14項(占全球相關12.28%)、“十二五”期間有27項(占全球相關23.47%)、“十三五”期間有26項(占全球相關45.61%)，其中申請單位以中國農業大學、吉林大學、華南農業大學、中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所最多。隨著轉基因生物新品種培育重大專項實施，我國的轉基因或基因編輯豬的研究得以快速發展，研究成果在數量上已經超過美國，但大部分或論文都是同一表型不同技術不同品種的制備，原創性還有待提高[9]。整體而言，我國的轉基因或基因編輯豬研發能力處于世界前列，其中節糧環保型轉基因豬、耐寒抗病豬、人類疾病模型等均處于地位。

2 基因編輯技術的概述
傳統的基因操作技術是將目的基因隨機插入到基因組內，這種隨機整合的方式會對后期基因編輯動物或人類疾病模型的研究帶來較大困難。近年來，ZFN、TALEN和CRISPR系統等基因編輯工具的發現和應用[4-8]，使動物基因組定點修飾獲得了突破性的進展。ZFN技術是最早被廣泛使用的基因編輯技術，其由特異的DNA識別域和非特異性限制性核酸內切酶(FokⅠ)組成，DNA識別域由3~4個串聯的可識別特異堿基三聯體的鋅指蛋白構成，FokⅠ二聚化后能切割基因組[10-13]。TALEN的原理與ZFN相似，但DNA識別模塊是由14~18個識別靶點序列的TAL單元串聯組成[14-17]，而CRISPR/Cas9技術擺脫了合成和組裝具有特異性DNA識別能力蛋白模塊的繁瑣操作，由一條外源單鏈向導RNA(sgRNA)和Cas9蛋白組成，sgRNA通過堿基互補配對原則識別基因組序列，并引導Cas9蛋白切割基因組[4-8]。隨后研究人員開發了一系列突變體Cas9系統，如VRER SpCas9[18]、VQR SpCas9[18]、XCas9 3.7(TLIKDIV SpCas9)[19]等，以及分子量更小、效率相當或更高的基因編輯工具，如SGN[20]、AsCpf1[21]、CjCas9[22]、SaCas9[23]、Cas14[24]等。這些系統本質上是在基因組DNA靶位點發生雙鏈斷裂(Double strand break，DSB)，激活體內非同源末端連接(Nonhomologous end joining，NHEJ)或同源定向修復(Homologous-directed repair，HDR) 2種不同的修復機制[4, 6, 25-26]，實現內源基因的敲除或外源基因的定點插入。近年來，該技術已成功應用到細菌、酵母、人類、果蠅、斑馬魚、小鼠、大鼠、家畜等多種生物，顯示了其強大的基因編輯優勢[1-2, 10, 27-28]?；蚓庉嫾夹g與體細胞克隆技術結合，可制備出具有重要經濟價值或醫學研究價值的基因編輯動物，在動物遺傳育種和人類疾病研究等領域具有廣闊的前景。

3 轉基因和基因編輯豬在農業領域中的應用
豬傳統育種手段，如純系選育和配套雜交等，培育理想經濟性狀所需要的周期較長，耗費大量的人力與物力，同時改良的程度受限于品種本身特性和基因型的影響，無法突破種源的限制引入新性狀，極大程度地影響了豬遺傳改良的發展。而轉基因與基因編輯技術的應用，很好地彌補了傳統育種的不足，為快速改良或提高豬生長發育、肉質質量、抗病能力等農業性狀提供了良好的解決措施。
3.1 提高產肉量
豬肉作為我國主要的肉類食品來源，提高豬的產肉量和瘦肉率是當前豬育種工作的重要目標。胰島素樣生長因子2 (Insulin-like growth factor 2，IGF2)是影響骨骼肌發育及脂肪沉積的重要影響因子[29-30]。1999年，Jeon等[30]發現IGF2第3個內含子存在3處核苷酸突變，顯著增加IGF2在肌肉組織中表達量有利于豬瘦肉率的提高。直到2018年，Xiang等[31]利用CRISPR/Cas9?技術成功獲得了IGF2基因第3個內含子一個保守的SNP位點編輯的巴馬豬。與野生型巴馬豬相比，IGF2基因編輯豬顯著提高了產肉量和瘦肉率。同樣，Liu等[32]通過CRISPR/Cas9?技術獲得雙等位基因缺失IGF2基因編輯豬，證明IGF2內含子3的突變對肌生成有著重要影響，為培育具有較高瘦肉率的兩廣小耳豬提供了依據。繼胰島素樣生長因子之后，Myostatin (MSTN)基因是被發現的又一新功能基因。MSTN基因是目前為止發現對肌肉生長起負調控作用，控制豬個體生長發育和脂肪沉積，改善豬產肉性能的有效基因，其突變可導致肌肉異常增長或產生雙肌臀表型。2015年，Qian等[33]利用ZFN技術成功獲得MSTN突變的基因編輯梅山豬，目前已經繁育第5代，雙等位突變基因編輯豬育種群瘦肉率顯著提高。隨后吳添文等[9]利用TALEN技術編輯MSTN基因成功制備梅山豬和大白豬，目前已獲準開展轉基因生物安全評價的中間試驗。此外，Wang等[34]利用CRISPR/Cas9技術對豬胎兒成纖維細胞MSTN基因進行定點編輯，通過核移植技術成功制備MSTN基因純合子敲除豬，該豬肌纖維數目顯著增加并表現出特定的“雙肌臀”現象。解偶連蛋白1(Uncoupling protein 1，UCP1)是調節動物脂肪沉積和抗寒產熱的關鍵因子。豬天然缺乏UCP1基因，棕色脂肪則沒有產熱性能，導致仔豬體溫調節不良，易受寒冷的影響。2017年，Zheng等[35]利用CRISPR/Cas9技術將外源性小鼠UCP1基因定點插入到豬內源性UCP1基因位點，成功獲得轉UCP1基因豬。該基因編輯豬彌補了仔豬自身產熱能力的不足，降低仔豬因寒冷應激而死亡的幾率；同時還減少了豬體內脂肪沉積，提高瘦肉率。利用ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9等基因組編輯技術制備與培育基因編輯豬，是豬生產性狀遺傳育種的一大飛躍。但中國豬種資源豐富，結合地方特色培育將不僅有利于促進豬的生長，提高豬的生產效益，而且有助于在畜牧業生產上改良育種。
3.2 提高豬肉品質
隨著人們生活水平的提高，人們對豬肉的需要也從最初的滿足需要向吃得香和吃得健康轉變。豬體脂中所含脂肪酸分為多不飽和脂肪酸(Poly unsaturated fatty acids，PUFAs)和飽和脂肪酸，其中不飽和脂肪酸是人體所需的必需脂肪酸，具有改善心血管，提高免疫功能等作用。由于豬體缺乏飽和脂肪酸脫氫酶，不能自主合成不飽和脂肪酸，因此豬肉中含有大量的飽和脂肪酸，食用過量，容易增加高血壓、高膽固醇等疾病的風險。2004年，Saeki等[36]將脂肪酸去飽和酶(Fatty acid desaturase-2，FAD-2)基因轉入豬的基因組中，轉FAD-2基因豬豬肉中不飽和脂肪酸的含量高于普通豬20%。此外，不飽和脂肪酸包括ω-3和ω-6，其中ω-3在改善心血管病癥中扮演著重要角色，但由于豬體內缺乏將ω-6脂肪酸轉化成ω-3脂肪酸的酶[37-39]，導致豬肉中ω-3含量較低，不能滿足人類健康飲食的需求。2006年，Lai等[39]在豬中過表達秀麗線蟲Fat-1基因，使豬肉中ω-6脂肪酸轉變為ω-3脂肪酸，成功培育出了富含ω-3脂肪酸的轉基因豬。隨后，Zhang等[40]和Li等[41]通過將Fat-1基因整合至豬基因組中，成功獲得中轉ω-3脂肪酸去飽和酶基因的轉基因豬，大大提高了豬肉的營養健康價值。Tang等[42]利用體細胞核移植技術，成功獲得表達2個脂肪酸去飽和酶Fat-1和Fat-2的轉基因豬，顯著提高肌肉，脂肪等組織中ω-3和ω-6的含量，為培育優質健康家畜新品種提供方法(數據未發表)。此外，影響豬肉品質的因素除脂肪中不飽和脂肪酸含量等內在因素外，肉色、肌間脂肪含量和肌纖維類型等仍然是目前豬肉品質研究的熱點。過氧化物酶體增殖受體γ輔激活因子α(Peroxisome proliferator-activated receptor gammaco-activator 1 alpha，PGC1α)是一種轉錄因子共激活因子，可誘導線粒體的生物合成和細胞呼吸功能，是調控肌纖維類型轉化的主要因子之一。為改善豬肉品質性狀，Zhang等[43]和Ying等[44]通過在豬肌肉中超表達PGC1α基因，使轉基因豬酵解型肌纖維減少，肉色鮮紅，滴水損失顯著降低，從而提高了豬肉的口感，有效解決了肉質和產肉量的矛盾。
3.3 提高飼料利用率
玉米、大豆和小麥等飼料原料中含有大量的非淀粉多糖，其將飼料營養物質包埋在細胞壁夾層或內部，同時通過阻礙消化酶與食糜的接觸，減慢營養物質向腸道的擴散速度，影響脂肪、淀粉和蛋白質等營養成分的吸收和利用[45-46]。傳統提高飼料利用率的方法包括根據豬生長和生理需要提供不同的營養配方和在飼料中添加酶制劑等，其中飼料中添加酶制劑在提高飼料營養消化效率的同時，有利于減少豬排泄中磷、氮排放。但酶制劑在生產應用過程中容易受各種因素的影響，如調制溫度、貯存時間和酶活性等，增加飼料成本的同時達不到提高消化效率的效果。2001年，Golovan等[46]利用小鼠腮腺蛋白啟動子制備轉植酸酶基因豬，使豬的飼料利用效率提高的同時，降低了75%的糞磷排放。隨后，該團隊對這批轉基因豬長達9代的跟蹤結果顯示，植酸酶基因可以穩定遺傳給下一代，同時在斷奶、生長、育肥階段可顯著提高飼料磷的消化率達20%以上。2015年，Lin等[47]通過原核注射方式獲得含轉纖維素酶基因豬，該豬飼料干物質和中性洗滌纖維的消化效率顯著提高，這將有利于提高豬對富含纖維飼料的攝入量，提高飼料利用效率。Huang等[48]和Zhang等[49]通過挖掘不同物種消化酶單基因在細胞表達水平的前提下，成功獲得轉木聚糖酶基因小鼠、轉葡聚糖酶基因豬和轉纖維素酶基因豬等模型動物。由于轉單一消化酶基因對飼料中纖維素、木聚糖和葡萄糖等成分消化效果甚微，Zhang等[45]將4個來自微生物的酶類基因bg17A、eg1314、xynB以及eappA整合到豬胎兒成纖維細胞基因組上，利用體細胞克隆技術培育出轉4種酶基因的新育種材料，該豬在飼養過程中氮磷排出顯著減少，同時對飼料中營養物質的攝取和吸收增加了，豬只生長速度快，育肥出欄快，該研究有望緩解養豬業的環境污染和糧食消耗等問題。
3.4 提高抗病性
豬病的爆發不僅給養殖業帶來了巨大的經濟損失，而且人畜共患病也嚴重威脅人類的安全。隨著越來越多的環保、抗生素殘留等問題的出現，科研人員意識到，單純依靠疫苗和藥物治療已經無法徹底防控豬病。近年來，利用轉基因和基因編輯技術，科研人員在豬抗病育種中獲得了較大進展。口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，FMDV)引起的一種偶蹄動物急性、高度傳播性疾病。2015年，Hu等[50]成功制備了靶向FMDV的轉干擾RNA的轉基因豬，該豬有效抑制FMDV病毒繁殖，不表現出感染病毒后的臨床癥狀和病理特征；隨后Xie等[51]利用同樣的方法，成功獲得定點整合轉shRNA的抗豬瘟轉基因豬，該豬有效抵抗豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CFSV)的感染。值得注意的是，Yan等[52]通過超表達抗黏液病毒基因(Myxovirus resistance gene，Mx1)也成功制備有效抵抗CFSV復制的轉Mx1基因豬。江戈龍等[53]通過細胞水平上篩選出能有效抑制圓環病毒(Porcine circovirus type 2，PCV2)的siRNA片段，并利用體細胞克隆技術成功培育出抗PCV2克隆轉基因豬，經過兩代的跟蹤結果發現，轉基因豬可有效抑制PCV2復制，且其余各項生長性能指標與野生型豬無顯著差異。
藍耳病全稱豬繁殖與呼吸障礙綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，是一種由PRRS病毒引起的繁殖障礙和呼吸系統的傳染病，是目前危害養豬業最嚴重的病毒性疫病之一。研究表明，清道夫受體CD163是PRRSV的主要受體基因[54-55]。從2013年起，Prather團隊針對PRRSV的受體做了多種基因敲除豬[56-58]，發現CD163第7外顯子雙等位基因敲除豬攻毒后未表現出臨床癥狀，具有良好的抗藍耳病能力[56]。該研究開創了利用基因編輯技術抵御豬病毒性傳染疾病的先河，自此之后多家育種公司和科研院所開啟了抗豬藍耳病基因編輯豬育種，并成功獲得了抗豬藍耳病豬群體[59-63]。Yang等[62]利用CRISPR/Cas9敲除SRCR5結構域的CD163，成功制備CD163敲除豬。與野生型對照相比，CD163基因編輯豬感染PRRSV后不表現高熱、呼吸障礙癥狀等臨床癥狀，血清指標及抗體指標均保持正常水平。除了藍耳病外，對于偽狂犬、非洲豬瘟、口蹄疫、圓環病毒病和流行性腹瀉等一系列豬病，如果可以用相同的技術手段，獲得免疫病毒感染的豬育種新材料，將對家畜抗病育種的研究具有重要的推動作用。
非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一種急性、烈性、高度接觸性的傳染病，阻礙了全球養豬業的健康發展。2018年8月3日，首例非洲豬瘟疫情在中國遼寧省沈陽市確診，隨后迅速蔓延至全國，給養豬業造成嚴重的經濟損失。盡管研究人員在免疫佐劑、DNA疫苗、弱毒疫苗和亞單位疫苗等方面做了大量的研究工作，但臨床結果表明這些疫苗均不能提供良好的保護效率[64]。2016年，Lillico等[65]研究發現，非洲疣豬可攜帶非洲豬瘟病毒卻不發病，而家豬在感染非洲豬瘟病毒后，死亡率高達?；蚪M測序分析發現，家豬和非洲疣豬在RELA基因上存在3個SNP位點的遺傳差異，這可能是家豬易感ASFV的一個重要原因。隨后該團隊利用ZFN技術將家豬RELA基因的3個SNP替換為非洲疣豬的SNP，成功制備了基因編輯豬[65]，可惜該豬并沒有后續報道，抗病效率還需要進一步確認。但這種通過高通量、大規模的全基因組選擇和測序分型方法，發現新型遺傳標記，并結合基因編輯技術精準驗證SNP位點，不僅改變目前全基因組選育中完全依賴算法造成的統計學誤差，而且打破了常規培育具有抗病性狀新品種的枷鎖。

4 轉基因和基因編輯豬在醫學領域中的應用
隨著基因編輯技術的發展，科研人員利用ZFN、TALEN和CRISPR等基因操作技術對豬基因組進行有目的的改造，獲得一大批有生物反應器、人類疾病模型和異種器官移植應用前景的豬模型[2-3, 28, 66-72]，這些豬模型可以大批量地生產活性蛋白藥物，提供異種器官用于緩解移植用器官不足等。同時這些具有特定功能或基因缺陷豬可以模擬人類復雜的疾病病癥與病程，目前已被廣泛用于心血管系統疾病、代謝性疾病、神經退行性疾病、囊性纖維化病和異種器官移植等生物醫學領域，對人類疾病治療方法的研究起到推動作用。
4.1 生物反應器
隨著醫療水平的發展和人們對重組蛋白藥物的接受度提高，傳統生產重組蛋白的方式已無法滿足人們的需求，必須尋求更的生產醫用蛋白的策略，其中豬生物反應器生產的重組蛋白因其活性高、質量好而被廣泛使用[73-74]。轉基因和基因編輯豬生物反應器是指利用豬特定組織或器官表達外源蛋白，以期從組織或器官中獲取重組蛋白，其中乳腺、血液和唾液腺為最常用的組織器官[75-79]。自從1987年報道首例乳腺生物反應器的小鼠模型[80]以后，研究人員迅速將其應用于豬等大動物研究，其中血清白蛋白、乳鐵蛋白和溶菌酶等表達已經達到商業化水平[74]。Bleck等[81]成功制備在乳腺中α?牛乳清蛋白特異性表達的轉基因豬，該豬在整個泌乳期內產生的牛乳清蛋白顯著高于對照組。隨后。Ma等[77]通過乳腺中高表達重組人α?乳清蛋白轉基因豬，增強仔豬斷奶前的腸道發育和日增質量的同時，成功獲得活性高的人重組乳清蛋白。人血清白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質，在維持血液滲透壓、體液平衡和營養供給等方面具有重要功能，在臨床上可以治療失血、創作等引起的休克或水腫等病癥[82]。Peng等[83]利用CRISPR/Cas9技術，將豬作為乳腺反應器動物生產人重組血清白蛋白，Li等[84]利用TALEN技術成功制備在血液中高表達人血清白蛋白的轉基因豬。Zeng等[85]通過構建唾液腺中表達人源神經生長因子的轉基因小鼠模型，證明其生物活性后運用至豬體內，成功制備了轉人源神經生長因子基因豬，目前正在分離純化鑒定中。這些生物反應器的發展與應用極大程度上彌補了小鼠等生物反應器蛋白表達總量相對較少、活性不高等缺點，為推動重組蛋白的應用作出了重要貢獻。
4.2 人類疾病模型
相對于小鼠等模式動物，豬的生理學、解剖學和遺傳學特征與人類非常接近，是一種研究人類疾病的更佳動物模型。心血管疾病是當代社會引起死亡高發的重要原因之一。血管性血友病(Von willebrand disease，vWD)是由血管性血友病因子(Von willebrand factor，vWF)基因缺陷所造成的，僅次于血友病的常見遺傳性出血性疾病。2014年，Hai等[86]通過顯微注射Cas9mRNA和靶向豬vWF基因sgRNA至豬胚胎，制備vWF雙等位敲除基因的廣西巴馬小型基因編輯豬，該豬出現嚴重的凝血功能障礙，與血管性血友病患者的臨床表現相似，這將為人類Ⅰ型和Ⅲ型血管性血友病的治療提供重要的模型支撐。此外，Zhou等[87]利用CRISPR/Cas9系統，針對皮膚白化病相關的酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)基因，成功建立人類白化病豬模型，為人類研究白化病發病機制及治療提供了重要的模型。PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor-γ)基因與人類心血管疾病、機體免疫及胰島素抵抗有著密切關系。2011年，Yang等[88]利用ZFN技術和體細胞核移植技術，成功生產出了2頭PPARγ基因敲除豬，后期研究發現該豬較好地擬合了人類心血管疾病病癥，為研究PPARγ在人類心血管疾病中的作用奠定了基礎。低密度脂蛋白受體(Low-density lipoprotein receptor，LDLR)是家族性高膽固醇血癥的主要致病基因，其特點是血液中膽固醇水平升高，增加動脈粥樣硬化與早發冠心病的風險。Carlson等[89]利用TALEN技術構建了LDLR基因敲除小型豬，建立了家族性高膽固醇血癥的理想試驗動物模型。Wang等[90]利用CRIPR/Cas9成功制備NPC1L1(Niemann-pick c1-like 1)敲除豬，為研究NPC1L1基因是如何影響人類對膳食和膽汁膽固醇的吸收提供新的信息。隨后，Huang等[91]利用CRISPR/Cas9技術成功制備了載脂蛋白E(Apo lipoprotein E，ApoE)和低密度脂蛋白受體LDLR雙基因敲除豬，該豬可表現出高甘油三酯血癥和重度高膽固醇血癥，為研究動脈粥樣硬化疾病提供的良好醫學模型。這些心血管疾病豬模型的建立，將為研究人類心血管疾病發病機理以及探索治療新方法等提供參考，顯示其巨大的市場潛力和產業化前景。
神經退行性疾病是由神經元和(或)其髓鞘喪失功能導致的，肢體功能障礙疾病，包括肌萎縮側索硬化癥(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、亨廷頓舞蹈癥(Huntington’s disease，HD)和帕金森綜合征(Parkinson’s disease，PD)等[92]。ALS又稱漸凍人癥，是一種致命的神經退行性疾病，目前尚未有效治療的藥物和方法。2014年，Yang等[93]針對ALS的致病基因SOD1進行基因編輯，成功構建了SOD1基因突變豬，該豬表現出漸凍患者的運動神經受損，肌肉萎縮等典型癥狀。隨后Wang等[94]利用轉基因技術針對另一個ALS的致病基因TDP-43，成功構建ALS豬模型，這將為ALS的治療提供有力保障。帕金森綜合征是另一種常見的神經退行性病癥，其發病機制相對ALS更為復雜，僅約10%的患者是由于某些特定基因突變導致，如DJ-1、parkin、PINK1和PINK2等[95-96]。2015年，Zhou等[87]利用CRISPR/Cas9技術同時成功構建PINK1和parkin雙基因敲除豬，隨后Zhou等[97]通過敲除PINK1和PINK2雙基因，成功獲得了PD豬模型；Wang等[98]利用CRISPR/Cas9顯微注射豬受精胚胎，成功制備DJ-1、parkin和PINK1 3個基因缺失的豬模型；遺憾的是這些豬模型并沒有檢測出PD的臨床癥狀，可能會隨著豬年齡的增長，最后表現出PD癥狀。HD是一種由Huntingtin(HTT)基因突變引起的腦部特定神經元退化的遺傳性疾病。2001年，Uchida等[99]通過顯微注射受精卵的方式，成功獲得HTT突變(75Q)的基因編輯豬。隨后，Yang等[100]通過體細胞克隆技術制備了HD豬模型(105Q或160Q)，Baxa等[101]通過構建2種不同N?端和全長的HTT(145Q)轉基因豬。雖然它們能檢測出突變的HTT表達，但行為表現和生活力上沒有表現出明顯的HD表型。2018年，Yan等[2]同樣應用CRISPR/Cas9技術將人源的突變HTT基因定點插入到豬HTT基因座內，建立了表達人源性全長突變型HTT的基因編輯豬，該豬模型精準地模擬出人類神經退行性疾病的特征，如運動、行為異常以及早死癥狀、大腦出現紋狀體神經元退化等，這將可以用于研究大型哺乳動物神經性疾病的發病機制及其治療方案。
作為研究人類疾病的理想模型，豬不僅在研究心血管疾病，神經退行性疾病方面作出卓越貢獻，在其他疾病如囊腫性纖維化(Cystic fibrosis，CF)、杜氏肌肉萎縮癥(Duchenne muscular dystropy，DMD)、癌癥等方面也有著其他動物不可比擬的作用。2008年，Rogers等[102-103]利用AAV介導的同源重組技術成功構建了囊腫性纖維化致病因子CFTR突變的豬模型。小豬出生后24~48 h出現明顯的胎糞梗阻，同時其他器官如胰臟、肝臟等均表現出與人類患者相似的特征，為研究與治療CF提供了新的平臺。2013年，Klymiuk等[104]通過敲除抗肌萎縮蛋白(Dystrophin)基因，獲得運動能力下降、肌肉萎縮和呼吸衰竭等病癥的DMD豬模型，可惜這些豬出生一周后幾乎都死亡，沒有一頭豬可以活到配種階段。隨后多個研究平臺相繼建立了DMD豬模型，如Yu等[105]通過CRISPR-Cas9技術敲除滇南小型豬受精卵DMD基因，成功地構建出人類DMD疾病模型；另外，利用大動物豬還構建了其他人類疾病模型，如結腸癌[106-107]、人甲減貧血和免疫缺陷[108]、胃癌[109]、神經性耳聾[110]、色素性視網膜炎[111]和多囊性腎病[112]等；這些疾病模型的建立將為人類疾病和家畜疫病的發病機理提供重要的模型支持，對疾病治療方法的研究起到推動作用。
4.3 異種器官移植
異種器官移植和異種細胞移植是解決人供體器官短缺的重要途徑，而豬則被認為是人體異種器官來源以及異種細胞再生的動物，其器官不但體積和組織結構上和人類器官非常相似，而且可避免靈長類動物作為異種供體源的倫理問題。盡管豬可能可以作為人體器官移植的供體，但直接將正常的豬器官移植至病人體內，會出現一系列的免疫排斥反應，如超急性排斥反應、急性血管性排斥反應和慢性排斥反應等。同時，豬內源性逆轉錄病毒(Porcine endogenous retroviruses，PERVs)對病人也具有潛在風險。因此如何避免免疫排斥反應和PERV的跨物種感染是實現豬的器官異種移植首要攻克的兩大難題。
免疫排斥反應是機體對移植物(異體細胞、組織或器官)通過特異性免疫應答使其破壞的過程，其中受體體內預存的天然異種抗體(Xenoreactive natural antibodies，XNAs)識別異種抗原Gal表位是產生免疫排斥的主要因素[113]。2002年，賴良學報道通過同源重組方法敲除豬α?1,3?半乳糖轉移酶基因(α-1,3-galactosyltranferase，GGTA1)，阻斷Gal表位的生成，有效克服異種器官移植的超急性排斥反應[114]。隨后，多個團隊先后利用基因編輯技術成功獲得GGTA1以及與免疫相關基因敲除的豬模型。2003年，Dai等[115]通過同源重組技術破壞豬α?1,3?半乳糖基轉移酶基因，成功制備了GGTA1基因缺陷豬模型；2011年，Hauschild等[116]利用ZFN制備了GGTA1的敲除豬；2013年，Xin等[117]利用TALEN技術再次對豬GGTA1基因進行敲除，得到雙等位基因敲除豬；2016年，Kang等[118]利用TALEN技術對豬的GGTA1基因進行敲除；2017年，Chuang等[119]利用CRISPR/Cas9原核顯微豬胚胎細胞，生產出GGTA1基因缺失的豬。除Gal表位免疫抗原外，單磷酸胞嘧啶?N?乙酰神經氨酸羥化酶(Cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH)基因編碼的β?1,4?N乙酰半乳糖氨基轉移酶2(β-1,4-N-acetylgalactosaminyl transferase 2，b4GALNT2)和N?羥乙酰神經氨酸(N-g1yco1ylneuraminicacid，Neu5Gc)是另外2種主要免疫抗原。2013年，Lutz等[120]利用ZFN基因編輯技術，成功獲得GGTA1/CMAH雙基因敲除豬模型，并在體外證明了GGTA1/CMAH雙基因敲除豬的免疫排斥反應相對單基因GGTA1敲除豬更小，更有利于實現異種器官移植。2014年，Li等[121]針對3個與免疫排斥相關的基因GGTA1、CMAH和異紅細胞糖苷酯合成酶(iGb3S)基因，利用CRISPR/Cas9技術獲得了單個基因或同時敲除2個或3個基因豬模型，隨后Estrada等[71]利用相同技術分別獲得GGTA1、GGTA1/CMAH和GGTA1/CMAH/β4GalNT2基因敲除豬，通過對比3種基因敲除豬，發現β4GalNT2基因敲除豬細胞與人源IgM和IgG抗體的結合能力明顯下降，表明該模型可有效降低異種移植中的抗原性。這些特異性抗原敲除豬模型的建立，將為掃除豬器官用于人體移植的安全障礙，推動豬器官的臨床應用奠定基礎。
PERV是指整合在豬基因組的病毒，一般在豬體內不會有毒性。當豬的細胞和人的細胞接觸時，內源性逆轉錄病毒會從豬的基因組“跳”到人的基因組，導致PERV的跨物種感染[122-123]。敲除豬基因組PERV序列可為避免PERV種間傳播，異種移植轉向臨床應用的醫療風險和生物安全問題提供解決措施。2015年，Yang等[124]利用CRISPR/Cas9技術全基因組范圍內敲除豬腎細胞系中所有62個拷貝的PERV基因，使人感染PERV的風險下降至以前的1/1 000；隨后Niu等[125]成功獲得世界首批內源性逆轉錄病毒滅活豬豬模型，為實現豬器官的異種移植提供了關鍵技術。綜上所述，轉基因或基因編輯豬的研究為異種器官移植的供體提供了巨大的可能性，同時為打破人類器官移植資源匱乏的現狀帶來了曙光。

5 總結
目前，科研人員已經成功制備出一系列特定功能的轉基因或基因編輯豬模型，隨著技術的不斷發展與成熟，未來將更加廣泛地應用到種質資源新品種創建、建立人類疾病模型、糾正缺陷性致病基因和消除病毒/細菌感染等農業或醫學領域。但是，轉基因或基因編輯豬的產業化推廣和應用仍有諸多問題需要克服。首先，利用體細胞克隆技術生產轉基因或基因編輯豬效率依然很低，僅有1%~2%左右，遠低于體內受精胚胎在母豬子宮內的發育效率。雖然研究人員通過優化供體細胞的選擇、減少供體細胞的傳代次數、矯正克隆胚胎基因組異常表觀遺傳修飾狀態等方式來提高克隆的效率，但對豬體細胞克隆效率提高幅度也非常有限，提高后的效率仍然不超過2%。低下的豬體細胞克隆效率使得基因編輯技術的應用成本大幅增加，迫切需要探索更為有效的方法來提高克隆豬的生產效率。其次，CRISPR/Cas9等基因編輯技術雖然能產生基因組靶位點DNA雙鏈斷裂，但以同源定向修復介導的定點突變和敲入效率仍然十分低下；同時該技術還存在明顯的脫靶效應，導致轉基因或基因編輯豬在器官移植等應用方面存在安全風險；因此如何降低基因編輯技術的脫靶效應、尋找提高基因組定點修飾效率的方法和降低制備轉基因或基因編輯豬模型的成本等問題仍需深入探討。再者，隨著高通量測序、全基因組水平關聯分析和功能基因研究等相關研究的發展和應用，越來越多的豬功能候選基因和人類疾病候選致病因子被相繼發現，如何利用基因編輯技術探索豬基因組功能、實現生產性狀的遺傳改良和克服物種差異、準確模擬人類疾病仍需要深入研究。最后，從中山大學黃軍就對不能發育的人類胚胎基因組進行編輯事件到原南方科技大學副教授賀建奎的“基因編輯嬰兒”事件，都在提醒和要求相關監管部門規范和加緊制定轉基因或基因編輯豬檢測和研究的相關標準，嚴格限制其應用的范圍，杜絕違規濫用現象。相信隨著基因編輯技術的完善，豬遺傳改良育種、人類疾病研究和藥物開發將迎來全新的機遇與挑戰。