過表達載體主要是將目的基因的編碼區（CDS）構建到相應的質?；蛘卟《据d體中，達到在目的基因過量表達的作用。常規過表達載體</B>主要元件：Promoter—gene—linker—Fluorescent gene—抗藥篩選gene?；蜻^表達載體又可以分為廣泛啟動子基因表達載體，組織特異性啟動子基因表達載體和誘導啟動子基因表達載體等，以達到不同研究所需要的目的。

載體構建(vectorconstruction)：為把DNA分子運送到受體細胞中去，必須尋找一種能進入細胞、在裝載了外來的DNA片段后仍能照樣復制的運載體。理想的運載體是質粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工構建的質粒作為載體。

過表達載體的構建方法及步驟

一、載體的選擇及如何閱讀質粒圖譜
目前，載體主要有病毒和非病毒兩大類,其中質粒 DNA 是一種新的非病毒轉基因載體。
一個合格質粒的組成要素：
（1）復制起始位點 Ori 即控制復制起始的位點。原核生物 DNA 分子中只有一個復制起始點。而真核生物 DNA 分子有多個復制起始位點。
（2）抗生素抗性基因 可以便于加以檢測，如 Amp+ ,Kan+
（3）多克隆位點 MCS 克隆攜帶外源基因片段
（4） P/E 啟動子/增強子
（5）Terms 終止信號
（6）加 poly（A）信號 可以起到穩定 mRNA 作用
選擇載體主要依據構建的目的，同時要考慮載體中應有合適的限制酶切位點。如果構建的目的是要表達一個特定的基因，則要選擇合適的表達載體。

過表達實例--pCAGGS質粒轉染小鼠原代神經元

載體選擇主要考慮下述3點：
【1】構建 DNA 重組體的目的，克隆擴增/基因表達，選擇合適的克隆載體/表達載體。
【2】.載體的類型：
（1）克隆載體的克隆能力－據克隆片段大?。ù筮x大，小選小 ） 。如<10kb 選質粒。
（2）表達載體據受體細胞類型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細胞表達載體。
（3） 對原核表達載體應該注意： 選擇合適的啟動子及相應的受體菌， 用于表達真核蛋白質時注意克服4個困難和閱讀框錯位；表達天然蛋白質或融合蛋白作為相應載體的參考。
【3】載體 MCS 中的酶切位點數與組成方向因載體不同而異，適應目的基因與載體易于鏈接 ， 不能產生閱讀框架錯位。
綜上所述，選用質粒（最常用）做載體的5點要求：
（1）選分子量小的質粒，即小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細菌里面拷貝數也多（也有大載體） ；
（2）一般使用松弛型質粒在細菌里擴增不受約束，一般 10個以上的拷貝，而嚴謹型質粒<10個。
（3）必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地；
（5）滿足自己的實驗需求，是否需要包裝病毒，是否需要加入熒光標記，是否需要加入標簽蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
 無論選用哪種載體， 首先都要獲得載體分子， 然后采用適當的限制酶將載體 DNA 進行切割， 獲得線性載體分子，以便于與目的基因片段進行連接。
 
如何閱讀質粒圖譜
步：首先看 Ori 的位置，了解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒）
第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記。
（1）Ampr 水解β－內酰胺環，解除氨芐的毒性。
（2）tetr 可以阻止四環素進入細胞。
（3）camr 生成氯霉素羥乙?；苌铮怪ザ拘?。
（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸轉移酶 使 G418（長那霉素衍生物）失活
（5）hygr 使潮霉素β失活。
 第三步：看多克隆位點（MCS） 。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些酶切位點以外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。質粒一般只能容納小于10Kb 的外源 DNA 片段。一般來說，外源 DNA 片段越長，越難插入，越不穩定，轉化效率越低。
第五步：是否含有表達系統元件，即啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號。這是用來區別克隆載體與表達載體?？寺≥d體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選用那種載體，還是要以實驗目的為準繩。

第六步：啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號
（1）啟動子－促進 DNA 轉錄的 DNA 序列，這個 DNA 區域常在基因或操縱子編碼序列的上游，是 DNA 分子上可以與 RNApol 特異性結合并使之開始轉錄的部位，但啟動子本身不被轉錄。
（2） 增強子/沉默子－為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉錄過程的調控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關。即在所調控基因上游或下游均可發揮作用。/沉默子－負增強子，負調控序列。
（3）核糖體結合位點/起始密碼/SD 序列（Rbs/AGU/SDs） ：mRNA 有核糖體的兩個結合位點，對于原核而言是 AUG（起始密碼）和 SD 序列。
（4） 轉錄終止序列（終止子）/翻譯終止密碼子：結構基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA的保守序列，此位點 down－stream 有一段 GT 或 T 富豐區，這2部分共同構成 poly（A）加尾信號。結構基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列，此位點 down－stream 有一段GT 或 T 富豐區，這2部分共同構成 poly（A）加尾信號。
質粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針， 那其實是代表兩條 DNA 鏈， 即質粒是環狀雙鏈DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上 .根據表達宿主不同，構建時所選擇的載體也會不同。
 
二、目的基因的獲得
 一般來說，目的基因的獲得有三種途徑：
調取基因：根據目的基因的序列，設計引物從含有目的基因的cDNA中通過PCR的方法調取目的基因，鏈接到克隆載體挑取單克隆進行測序，以獲得想要的基因片段，這種方法相對成本較低，但是調取到的基因往往含有突變，還有不同基因的表達豐度不同，轉錄本比較復雜，或是基因片段很長，這些情況都很難調取到目的基因。
全基因合成：根據目的基因的DNA序列，直接設計合成目的基因。此方法準確性高，相對成本會高一些，個人操作比較困難，需要專業的合成公司完成。優點是可以合成難調取及人工改造的任何基因序列，同時可以進行密碼子優化，提高目的基因在宿主內的表達量。

三、克隆構建
目前，克隆構建的方法多種多樣，除了應用廣泛的酶切鏈接以外，現在還有很多不依賴酶切位點的克隆構建方式。下面具體說一下雙酶切方法構建載體的步驟。

（2）X基因慢病毒載體的構建
X基因 基因由Transheep全基因合成，構建于載體PUC57中。PUC57-X基因 EcoRI/BamHI酶切結果：
Lane1：GeneRay 1kb DNA Ladder (從上至下依次為：3000bp, 2000bp, 1500bp, 1000bp,  500bp, 250bp,100bp)
Lane2：PUC57-Neurod1 EcoRI/BamHI酶切產物
酶切完成后進行膠回收
2. 載體用pCDNA3.1雙酶切，酶切體系如下。
20ul酶切體系    37度3小時

酶切完成后膠回收（見附錄）
Lane1：GeneRay 1kb DNA Ladder (從上至下依次為：12000bp, 8000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 3000bp, 2500bp, 2000bp, 1500bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp)
Lane2： pcDNA3.1載體酶切回收產物
轉化 (感受態細胞: DH5a),具體步驟見附錄轉化部分。
抗性: Amp; 37℃，培養過夜
轉化后X基因分別平板挑菌, 37℃ 250轉/分鐘搖菌14小時，PCR鑒定后，將陽性菌液送上海權陽生物技術有限公司測序。
X基因 慢病毒載體單克隆菌落PCR鑒定（使用載體通用引物,PCR條帶大小應比實際大200bp左右）：
Lane1：GeneRay 1kb DNA Ladder  (從上至下依次為：2000bp, 1500bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp,100bp)
Lane2-4： X基因 菌落鑒定PCR產物

載體構建中需要注意些什么？
一、PCR 過程中的經驗教訓
做分子克隆，構建表達載體的過程中，目的片段必須跟genebank 中的序列完全一致才行，所以在 PCR 過程中酶的選擇首先應選擇高保真酶，尤其是當目的片段較長的時候更是如此。這樣才能在 PCR 過程中減少錯配情況。高保真酶常常對退火溫度有要求，對一般的酶來說，退火溫度是 Tm-5 度，但如 NEB 的高保真酶的退火溫度是 Tm 值+3 度。PCR 循環數不宜太大，20-30 即可。我就曾經用普通的酶進行過 PCR，擴增時出現非特異條帶，T-A 克隆后送去測序，發現堿基有錯配，而且每次都不一樣。

二、PCR 產物直接酶切后連接不成功
當你獲得 PCR 產物后，首先是進行純化、酶切、純化，然后與酶切后膠回收的載體連接，如果連接成功，當然是恭喜了。但往往會出現連接不成功的，原因以 PCR 產物沒有酶切成功可能性大，這可能與引物設計的好壞有關。因為這個時候 PCR 產物是否酶切成功是無法鑒定的，所以你反復嘗試幾次還不成功的話，就趕緊做個 T-A 克隆吧

三、T-A 克隆應注意的問題
T-A 克隆應該時間很簡單的事，但知者不難，難者不知啊，還是有很多問題要注意的。T-A 陽性率高，簡單易操作，所以在質粒構建過程常常用來選擇做為一個亞克隆，既可以用來測序，又有利于進一步酶切，確實很方便。但要注意，首先是 T 載體的選擇，盡量避免選擇含有目的片段酶切位點的 T 載體，這樣會切成多個片段，有時候可能對后面的膠回收會有影響。其次，因為在 PCR 產物是用高保真酶擴增的，所以首先要進行加 A 反應。這時候應購買 T-A 快速克隆平末端加A 試劑盒。進行加 A 時反應體系不要太小，因為太小是酶量加的可能不準確。我開始就是這樣，想著節約，說明書寫的是 PCR 產物加 15ul,我沒舍得，加了 3ul,加A 反應液、酶都相應減量，后面就是轉化不成功。后來我 PCR 產物加為 6ul,就成功了，屢試不爽。最后，在連接產物加入感受態細胞后，輕彈混勻，稍微離心一下，不要劇烈的震蕩，反正我失敗的時候都是力度較大，也不知道有沒有關系。

四、菌液 PCR
T-A 克隆成功后，你可以看到很多藍白斑，一般來說藍斑要比白斑稍多。不是每個白斑都是你要的東西，下面就是陽性克隆的篩選了。挑白斑到搖菌管過夜搖菌，然后進行菌液 PCR。關于菌液 PCR 引物的問題，有的人用克隆引物，有的人用專門設計的檢測引物，兩者我都用過，只要檢測引物能 P 出來，克隆引物也能 P出來，完全符合，所以一般的時候用克隆引物就可以了，除非運氣不好，真好在起始點就出現錯配的情況。

五、堿法小提質粒
挑取陽性克隆的菌液，抽提質粒吧。既然是小提，就不要很多菌液，一管就夠了，3-5 毫升，開始以為菌液越多越好，其實是錯的，首先這點菌液提的質粒夠你測序及酶切用了，其次加多了反而不好，因為加的裂解液是相對固定的，多了可能裂解不完全啊。提取質粒有傳統的自己配制的酚氯仿抽提，也可以購買試劑盒。我還是傾向于用試劑盒，尤其是像我們這些并不打算在實驗方面有所專長的初學者。國產的試劑盒很便宜，如天根的質粒小提試劑盒，一次大約也就 4 塊錢，足夠用的了。而用酚氯仿抽提吧，很容易出現質粒不純的情況，在測序時無法測出信號。當然，這也可能跟個人有關，師姐們都建議后者，在他們看來，簡單實用，價格更便宜。如何選擇，就看自己的了。

六、酶切膠回收
測序結果正確的話那就恭喜你了，至少你已經拿到了目的片段，下面就酶切膠回收吧。將目的片段及載體進行酶切，并行酶失活，然后電泳膠回收。我回收過幾次，但回收效率不高，也不知是什么原因。跑膠時條帶很亮，酶切也很充分，但一回收就沒了，尤其是目的片段常常都看不到。很郁悶，這時候我多做了兩個酶切回收體系，同時進行膠回收，加大量回收后跑電泳總算能看到目的片段了，雖說不亮，但總算有。個人認為，將 50ul 的酶切體系不要放在一個孔里面跑膠而是分成兩到三個孔跑膠然后回收可能會增加回收的效率。

七、酶切產物連接
載體與目的片段的摩爾比常常為  1：3-10，但酶切回收后的產物測濃度常常測不出來。怎么去按這個比例進行連接反應呢。回收后將目的片段和載體同時跑膠比較亮度，根據亮度的比較再結合分子量來確定兩者的體積比。如亮度比為 5：1，兩者的分子量比 10：1，體積比大約為 1：3.  不要擔心產物的濃度低會影響連接，其實連接只要那么一點點就夠了。我的陽性對照加的質粒只有 0.1ng，結果菌落長得滿滿的。

八、挑取陽性克隆送測序
轉化成功后挑取陽性克隆的菌液進行質粒小提，同時保存菌種，送測序。