Western Blotting

蛋白質印跡法（免疫印跡試驗）即Western Blot。它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。

蛋白質印跡法是由瑞士米歇爾弗雷德里希生物研究所（Friedrich Miescher Institute）的Harry Towbin在1979年提出的。在尼爾·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化學》（Analytical Biochemistry）中被稱為western Blot。蛋白免疫印跡（western Blot）是將電泳分離后的細胞或組織總蛋白質從凝膠轉移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質檢測技術，現已廣泛應用于基因在蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。

Western Blotting原理

與Southern Blot或Northern Blot雜交方法類似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。

Western Blotting操作步驟

試劑準備

1、SDS-PAGE試劑：見電泳實驗。

2、勻漿緩沖液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.0ml；10%SDS 6.0ml；β-巰基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。

3、轉膜緩沖液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。

4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。

5、膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉，現配）：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。

6、顯色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸鎳胺 0.1ml；H202 1.0μl。

樣品制備

1、單層貼壁細胞總蛋白的提取：

（1）倒掉培養液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養液（或將瓶直立放置一會兒使殘余培養液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。

（2）每瓶細胞加3ml 4℃預冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動1min洗滌細胞，然后棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養液。將PBS棄凈后把培養瓶置于冰上。

（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。）

（4）每瓶細胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細胞充分裂解培養瓶要經常來回搖動。

（5）裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養瓶的一側（動作要快），然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中（整個操作盡量在冰上進行）。

（6）于4℃下12000rpm離心5min（提前開離心機預冷）。

（7）將離心后的上清分裝轉移到0.5ml的離心管中放于－20℃保存。

2、組織中總蛋白的提取：

（1）將少量組織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。

（2）加400 μL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進行勻漿。然后置于冰上。

（3）幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復碾幾次使組織盡量碾碎。

（4）裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4℃下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃保存。

3、加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取：

由于受藥物的影響，一些細胞脫落下來，所以除按（一）操作外還應收集培養液中的細胞。以下是培養液中細胞總蛋白的提取：

（1）將培養液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min。

（2）棄上清，加入4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS重復洗滌一次。

（3）用槍洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解過程中要經常彈一彈以使細胞充分裂解。

（4）將裂解液與培養瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃保存。

電泳(Electrophoresis) 

(1) SDS-PAGE凝膠配制 

  SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻資料進行配制，也可以使用凝膠配制試劑盒。該試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。 

(2) 樣品處理 

    在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關文獻資料配制，也可以使用SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)(P0015)。    100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。 

(3) 上樣與電泳 

冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內即可。 為了便于觀察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，更好使用預染蛋白質分子量標準(P0066)。  電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍進入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標準電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設置在80-100V，高電壓可以設置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求，也可以采用碧云天的多功能電泳儀(帶定時)(EEP102)。為了電泳方便起見，也可以采用整個SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設置在100V，然后設定定時時間為90－120分鐘。設置定時可以避免經常發生的電泳過頭。

    通常電泳時溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據預染蛋白質分子量標準的電泳情況，預計目的蛋白已經被適當分離后即可停止電泳。

轉膜(Transfer) 

    我們推薦在Western實驗中選用PVDF膜(FFP36/FFP39)。硝酸纖維素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產商的推薦使用步驟。  通常如果使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置，可以設定轉膜電流為300-400mA，轉膜時間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉膜過夜。具體的轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉膜時間越短。

    在轉膜過程中，特別是高電流快速轉膜時，通常會有非常嚴重的發熱現象，更好把轉膜槽放置在冰浴中進行轉膜。 轉膜的效果可以觀察所使用的預染蛋白質分子量標準，通常分子量更大的1-2條帶較難全部轉到膜上。轉膜的效果也可以用麗春紅染色液(P0022)對膜進行染色，以觀察實際的轉膜效果。也可以用考馬斯亮藍快速染色液(P0017)對完成轉膜的SDS-PAGE膠進行染色，以觀察蛋白的殘留情況。 

封閉(Blocking) 

   用紫外交聯儀轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預先準備好的Western洗滌液(P0023C)中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉膜液。從轉膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產生較高的背景。 用微型臺式真空泵(EVAC06/EVAC07)或滴管等吸盡洗滌液，加入Western封閉液(P0023B)，在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60分鐘。對于一些背景較高的抗體，可以4℃封閉過夜。側向擺動速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜。 

一抗孵育(Primary antibody incubation) 

   參考一抗的說明書，按照適當比例用Western一抗稀釋液(P0023A)稀釋一抗。 用微型臺式真空泵或滴管等吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以4℃緩慢搖動孵育過夜。或更據抗體的說明選擇適當的孵育溫度和時間。回收一抗。加入Western洗滌液(P0023C)，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。 

    注：Western結果通常需要提供內參作為對照，通常可以選用Tubulin抗體(AT819)或Actin抗體(AA128)，進行內參檢測。 

 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 

    參考二抗的說明書，按照適當比例用Western二抗稀釋液(P0023D)稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗。 二抗需根據一抗進行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗，如辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)。碧云天有多種二抗提供。 用微型臺式真空泵或滴管等吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。回收二抗。加入Western洗滌液(P0023C)，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。

蛋白檢測(Detection of proteins) 

    參考相關說明書，使用BeyoECL Plus(P0018)等ECL類試劑來檢測蛋白。壓片可以采用專用的壓片暗盒(FFC58/FFC83)進行。 

    洗片時可以使用X光片自動洗片機。如果沒有自動洗片機，可以用顯影定影試劑盒(P0019/P0020)自行配制顯影液和定影液進行手工洗片。X光片推薦選用柯達原裝的生物實驗專用柯達X-OMAT BT膠片(FF057/FF081)。