DAPI染色DNA的原理及DAPI使用方法

DAPI 即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，分子式為C16 H15 N5 ·2C3 H6 O3 ，分子量457.48。DAPI 為一種熒光染料，可以穿透細胞膜與細胞核中的雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)揮標(biāo)記的作用，可以產(chǎn)生比DAPI自身強20多倍的熒光，和EB相比，對雙鏈DNA的染色靈敏度要高很多倍。顯微鏡下可以看到顯藍色熒光的細胞，熒光顯微鏡觀察細胞標(biāo)記的效率高(幾乎為100 %) 。DAPI染色常用于細胞凋亡檢測，染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測。DAPI也常用于普通的細胞核染色以及某些特定情況下的雙鏈DNA染色。細胞經(jīng)熱激處理后用DAPI染色3分鐘，在熒光顯微鏡下可以看到到細胞核的形態(tài)變化。

DAPI 是一種能夠與DNA強力結(jié)合的熒光染料。它結(jié)合到雙鏈DNA小溝的AT堿基對處，一個DAPI分子可以占據(jù)三個堿基對的位置。結(jié)合到雙鏈DNA上DAPI分子的熒光強度提高大約20倍，常用與熒光顯微鏡觀測，根據(jù)熒光的強度可以確定DNA的量。另外，因為DAPI可以透過完整的細胞膜，它可以用于活細胞和固定細胞的染色。在熒光顯微鏡觀察下，DAPI染劑是利用紫外光波長的光線激發(fā)。單獨DAPI的更大吸收波長為340nm，更大發(fā)射波長為488nm；當(dāng)DAPI與雙鏈DNA結(jié)合時，更大吸收波長為364nm，更大發(fā)射波長為454nm（10 mM Tris pH7.0，100 mM NaCl，10 mM EDTA），其發(fā)散光的波長范圍含蓋了藍色至青綠色。DAPI也可以和RNA結(jié)合，但產(chǎn)生的熒光強度只有與DNA結(jié)合的熒光強度的1/5，其發(fā)散光的波長范圍約在500nm左右。

DAPI實驗的基本原理：

利用固定劑（通常是甲醛或多聚甲醛）將細胞固定，使得細胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白變性，從而使通透性進一步加強。利用正常羊血清封閉，可以令許多蛋白先與血清內(nèi)的非特異性抗體結(jié)合，而特異性的抗體由于動力學(xué)的關(guān)系可以通過競爭性的反應(yīng)與目的蛋白結(jié)合，這一過程可以保證抗體識別的特異性。二抗可以特異性識別一抗的Fc區(qū)域，利用二抗連接不同的熒光基團，就可以在熒光顯微鏡下觀察到不同的熒光，從而顯示目的基因的表達情況。另外，免疫熒光實驗由于其較高的敏感性可以顯示出基因表達的亞細胞情況(核內(nèi)，核外，膜上以及一些較大的細胞器上)，所以通常被用來作為基因定位的方法。

DAPI的配制及貯存

固體粉末 ：避光，2-8 ℃保存，3年沒有問題。
貯存液 ：用無菌水配制成濃度1 mg/ml 的貯存液，配好后用錫紙包起來，避光，可在-20 ℃下長期保存。（DAPI易溶于水，在PBS中溶解度不高）
使用濃度 ：貯存液用1xPBS稀釋到終濃度100 ng/ml。
熒光封片液 ：0.5 mol/L碳酸鹽緩沖液與甘油等體積混合，pH9.5
染色與觀察 ：制好的玻片上滴加幾滴DAPI染液，染色10分鐘，流水沖去染液，濾紙吸除多余水分，加一滴熒光封片液，置于熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長360-400nm。
注意事項 ：DAPI可能具有致癌性，全部操作過程中必須帶塑料或乳膠手套。

DAPI實驗步驟

1)在染色前的細胞密度約是0.8X105/孔（293T細胞/六孔板每孔）。
2)移去完全培養(yǎng)基，用PBS清洗一次。
3)用10％的甲醛溶液或者4%的多聚甲醛PBS在室溫固定20分鐘。
4）用PBS在室溫漂洗三次，每次10分鐘。
5）用含0.5%Triton-X-100的PBS在室溫通透化處理15分鐘。
6）用PBS在室溫漂洗三次，每次10分鐘。
7）在室溫用含10%NGS的PBS封閉1小時，或者在4攝氏度封閉過夜。
8）在37攝氏度用特異性一抗孵育半小時，或者在室溫下孵育一小時以上或者4攝氏度孵育過夜。
9）用含0.1% Tween-20的PBS在室溫漂洗三次，每次10分鐘。
10）用鋁箔包裹后在37攝氏度用二抗孵育半小時以上，或者在室溫下孵育一小時以上。
11）去除二抗，加入DAPI染色液室溫作用15分鐘以上。
12）用含0.1% Tween-20的PBS在室溫漂洗三次，每次10分鐘。
13）在熒光顯微鏡下觀察，用合適波段激發(fā)，照相保存實驗結(jié)果。

dapi染色觀察到藍色熒光是活細胞還是死細胞？
DAPI染色不能區(qū)分活死細胞，因為DAPI可以透過完整的細胞膜，它可以用于活細胞和固定細胞的染色。活細胞死細胞都能夠被DAPI染色，所以光看到藍色熒光，無法區(qū)分。
DAPI是一種能夠與DNA強力結(jié)合的熒光染料，常用于熒光顯微鏡觀測。類似于DAPI技術(shù)，赫斯特染色是一種既可以用于活細胞也可以用于固定細胞的藍色熒光染料，并且可以使用與DAPI相同的機器濾鏡設(shè)置。

dapi染料的激發(fā)光波長和發(fā)射光波長光譜圖：