熒光顯微鏡觀察熒光蛋白的方法和注意事項

熒光顯微鏡(Fluorescence microscope) ： 熒光顯微鏡是以紫外線為光源，用以照射被檢物體，使之發出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細胞內物質的吸收、運輸、化學物質的分布及定位等。細胞中有些物質，如葉綠素等，受紫外線照射后可發熒光；另有一些物質本身雖不能發熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經紫外線照射亦可發熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質進行定性和定量研究的工具之一。

熒光顯微鏡觀察GFP熒光蛋白使用方法

（1）打開熒光顯微鏡燈源，超高壓汞燈要預熱15min才能達到最亮點。
（2）透射式熒光顯微鏡需在光源與暗視野聚光器之間裝上所要求的激發濾片，在物鏡的后面裝上相應的壓制濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發濾片、雙色束分離器、壓制濾片的插塊。
（3）用低倍鏡觀察，根據不同型號熒光顯微鏡的調節裝置，調整光源中心，使其位于整個照明光斑的中央。
（4）放置GFP標本片，調焦后即可觀察。使用中應注意：未裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀察標本時，必須用無熒光的特殊鏡油；高壓汞燈關閉后不能立即重新打開，需待汞燈完全冷卻后才能再啟動，否則會不穩定，影響汞燈壽命。
（5）觀察。例如：在熒光顯微鏡下用藍紫光濾光片，觀察到經0.01%吖啶橙熒光染料染色的細胞，細胞核和細胞質被激發產生兩種不同顏色的熒光(暗綠色和橙紅色)。

熒光顯微鏡操作注意事項

（1）嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。
（2）應在暗室中進行檢查。進入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發出強光穩定后，眼睛完全適應暗室，再開始觀察標本。
（3）防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡。
（4）檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過2～3h。
（5）熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再用時，須待燈泡充分冷卻后才能點燃。中應避免數次點燃光源。
（6）GFP標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發。長時間的激發光照射標本，會使得熒光衰減和消失現象，故應盡可能縮短照射時間。暫時不觀察時可用擋光板遮蓋激發光。
（7）GFP標本觀察時候應采用無熒光油，應避免眼睛直視紫外光源。
（8）電源應安裝穩壓器，電壓不穩會降低熒光燈的壽命。

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