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植物組織培養的設備和操作方法

作者:生命科學事業部時間:2019-11-10 21:07:02瀏覽2745 次

信息摘要:

植物組織培養是在嚴格的無菌條件下培養植物材料。要達到無菌操作和無菌培養,就需要人為創造無菌的環境,使用無菌的器具,同時還需要人工控制的溫度、光照、濕度等培養條件。無菌環境和無菌條件的創造需要一定的設備,實驗設備因工作的目的、具體的任務和所具有的條件而異。但大多數采用化學實驗室、微生物實驗室及醫療上的一些設備、器材和用具。

植物組織培養的設備與使用方法
植物組織培養是在嚴格的無菌條件下培養植物材料。要達到無菌操作和無菌培養,就需要人為創造無菌的環境,使用無菌的器具,同時還需要人工控制的溫度、光照、濕度等培養條件。無菌環境和無菌條件的創造需要一定的設備,實驗設備因工作的目的、具體的任務和所具有的條件而異。但大多數采用化學實驗室、微生物實驗室及醫療上的一些設備、器材和用具。

1. 實驗室基本組成
(a)無菌操作室
在植物組織培養中,無菌操作室(clean chamber)是進行植物材料的分離及培養體轉移的一個重要場所。由于植物組織培養需長時間的無菌操作,所以無菌條件的好壞對組織培養成功與否起重要作用。微生物的培養生長時間短,而植物組織培養短的一個月,長的達幾年。所以,防止細菌和霉菌混入是提高工作效率和影響生產成本的關鍵。
無菌操作室基本要求是:干凈無菌、密閉、光線好。一般安裝滑動門,使空氣不致流動,以防外界菌及塵埃的侵入;墻壁光滑平整,地面平坦無逢,便于清潔工作;室內安裝紫外線燈,以便滅菌,還要有照明裝置及燈座,以備臨時增加設備之用;室內有超凈工作臺、便攜式激發光源、移動式載物臺(醫用平板推車)、廣口瓶、試管、三角瓶、酒精燈、接種工具、高強度紫外線燈等。面積根據工作性質可大可小,小的無菌操作室一般一間 5~7㎡即可。
接種室內主要安放超凈工作臺,分單人使用和雙人同時連續作業使用兩種。超凈臺中準備接種用的器具,如尖頭小鑷子、彎頭小鑷子、接種針、解剖刀、手術剪刀等,以及酒精燈、儲存70%酒精浸泡的棉球的廣口瓶等。如果進行生長點或幼胚等細小結構的分離與接種,還應當在超凈工作臺內放置一臺小型的雙目解剖鏡,以便觀察、解剖和分離細小的外植體。
小型離心機主要用于分離和收集液體培養中的細胞、單花粉及原生質體等,也可用來篩選處于不同發育階段的胚狀體。無菌室外更好設置預備室作為緩沖間,以防工作人員進出時帶進雜菌。控溫光照培養箱可以安放在緩沖間內。預備室與無菌室之間更好以玻璃相隔,便于觀察和參觀。在預備室可放置工作服、鞋、帽等,也需要裝自來水和254nm短波紫外線燈

(b) 化學實驗室
組織培養中植物材料是生長在人工配制的培養基上,這就需要在化學實驗室預先配制好培養基。化學實驗室一般由以下幾個部分組成:
(1)洗滌室
主要用于培養容器、玻璃器皿、用具和培養材料的清洗。新購進的玻璃器皿一般先用1%鹽酸除去可溶性無機物,再用中性洗滌劑;使用中的玻璃器皿可用洗滌劑清洗,自來水沖洗;對較難洗滌的器皿,如吸管等應用洗液進行洗滌。洗滌室需備有工作臺面、上水管和下水管、水池、落水架、電源、干燥箱等。
(2)藥品室
用于存放無機鹽、維生素、氨基酸、糖類、瓊脂、生長調節物質等各種化學藥品。要求室內干燥、通風、避免光照。室內設有藥品柜、冰箱等設備。各類化學試劑按要求分類存放,需要低溫保存的藥劑應置于冰箱保存。有毒藥品應按規定存放和管理。
(3)稱量室
根據需要,配備各類天平。要求干燥、密閉、無直射光照。一般配備 1/100 普通天平和 1/10000 的電子天平,可能的話加配 1/1000 和1/100000 的天平,形成系列。除電源外,應設有防震固定的臺座。
(4)培養基配置室
用于配制、分裝培養基以及培養基的暫時存放。室內應配有各種試管、三角瓶、燒杯、量筒、吸管、移液器等器具;有平面實驗臺以及安放藥品和器皿的各類藥品柜、器械柜、物品存放架;有水浴鍋、電飯鍋、微波爐、過濾裝置、酸度計、分注器以及貯藏母液的冰箱等。
(5)滅菌室
用于器皿、器械、封口材料和培養基的消毒滅菌。要求墻壁耐濕、耐高溫。室內需要備有高壓蒸汽滅菌裝置、細菌過濾裝置、煤氣灶和電爐等。玻璃器皿和小用具的消毒常采用干熱滅菌法,150℃約保持 1-3h。培養基、蒸餾水及一些用具,采用 120℃高壓蒸汽滅菌法。在沒有條件的地方,可將上述工作合并在一個房間內完成,但設備的安裝與排列要合理,房間要寬敞、 明亮、通風。
(c)培養室(culture room)是將接種到試管等的培養材料進行培養生長的場所。需配有固定式培養架、旋轉式培養架、轉床和搖床、控溫控光設備,以滿足植物器官(芽、莖、花藥等)、愈傷組織、細胞和原生質體的固體和液體培養的需要。
進行固體培養和試管苗大量繁殖時,培養材料通常擺在培養架上,制作培養架應考慮使用方便、節能、充分利用空間以及安全可靠。培養架材料為金屬、鋁合金或木制品。隔板可用玻璃板、木板、纖維板、金屬板等,更好使用玻璃板或鐵絲網,既透光,上層培養物又不受熱。為使用方便,通常設計為 5-7 層,更低一層離地面高約 50cm,以上每層間隔 30cm 左右,培養架高約1.7-2.3m。一般在每層上方裝置日光燈以供補充光照,培養架長度通常根據日光燈的長度設計。寬度可根據工作情況而定,一般裝 2 支日光燈,寬40-50cm。更好使用專門為組織培養設計的節能冷光源,其光譜與日光相近且省電。每日照明時間根據培養物的特性不同而有所區別,一般為 10-16h,更好用自動計時器控制光照時間。
培養室要保持一定的溫度條件,大多數情況保持在 20-27℃,要求室內溫度均勻一致。室內濕度也要求恒定。為防止培養基的干燥和菌類污染,相對濕度為70%-80%為好。溫濕度的保持可用空調機或濕機通過繼電器、石英定時開關鐘、控溫儀等來控制。大多數恒溫培養,應根據要求預先調節好。溫動變動太大,易使培養材料遭受菌類污染。
培養室應保持整潔。有條件的可裝置細菌過濾裝置。如需進行液體培養,還應根據培養的種類放置搖床、轉床等各種培養裝置。轉床上的培養瓶不停的轉動,瓶內培養物交替地處于液相和氣相,保證了良好的通氣條件,有利于培養物的生長。有的實驗要求暗培養,因此應有暗培養的設備,如柜子或無光培養箱。此外,為避免蟲類侵染,培養室應杜絕栽培植物。培養室附近也應盡量避免放置盆花等植物。

(d)細胞學觀察室
用于觀察、記錄培養材料的生長情況及結果。室內要有固定的水磨石或瓷磚臺板,以放置顯微鏡、解剖鏡、倒置顯微鏡及照相設備等儀器。
(e)馴化移栽室
用于試管苗的移栽。通常在溫室或塑料大棚內進行。室內備有彌霧裝置、遮蔭網、移植床等設施;缽、盆、移植盤等移植容器;草炭、蛭石、沙子等移植基質。試管苗移植一般要求溫室溫度在 15℃-35℃,相對濕度70%以上。

Teak-Tissue-Culture.jpg


2.超凈工作臺使用
無菌操作應在超凈工作臺中進行。超凈工作臺內在都裝有一個小電動機,它帶動風扇鼓動空氣先穿過一個粗過濾器,把大的塵埃濾掉,再穿過一個過濾器,把大于0.3μm的顆粒濾掉,然后這種不帶真菌和細菌的超凈氣流吹過臺面上的整個工作區域。由過濾器吹出來的空氣的速度大約是(27±3)m/min,所有的污染物都會被這種超凈氣流吹跑。只要超凈工作臺不停的運轉,在臺面上即可保持一個完全無菌的環境,而且這種氣流不會吹滅在臺面上使用的酒精燈。為了延長過濾器的使用壽命,超凈工作臺不要安放在塵埃多的地方,需定期檢查超凈工作臺臺面上的風速是很有必要的。在每次開動超凈工作臺時,應讓氣流吹 10min 后再開始操作。在每次操作之前,要把實驗材料和需使用的各種器械、藥品等先放入臺內,不要中途拿進。同時臺面上放置的東西也不宜太多, 特別注意不要把物件堆得太高,以免擋住氣流。在使用超凈工作臺時應注意安全,當臺面上的酒精燈已經點燃以后,千萬不要再噴灑酒精消毒臺面,否則很易引起火災。

Agromillora_tissue_culture_lab.jpg

3.無菌操作的步驟
1)將植物組織塊放入一個廣口玻璃瓶中,加入含有幾滴活化劑的濃度適當的消毒液,使材料完全浸沒在消毒液中,蓋上瓶蓋,把玻璃瓶置于超凈工作臺,在消毒期間不時搖動玻璃瓶。
2)消毒結束后,打開瓶蓋,將消毒液倒出,注入適量的無菌蒸餾水(經高壓滅菌后),再蓋上蓋,搖動數次,將水倒掉,如此重復 3-4 次。
3)將材料取出,放在一個已經滅過菌的培養皿中。
4)在對植物材料進行消毒處理的同時,對所要使用的器械進行消毒,先在90%酒精中蘸一下取出,在酒精燈火焰上消毒,然后放在器械架上冷卻備用。所有操作器械在每次使用后均需要再用火焰消毒一次。
5)使用消過毒的器械(如解剖刀、解剖針、打孔器、剪刀等)從已經過表面消毒的材料切取適當的外植體。如果需要用解剖鏡,應事先用 70%酒精棉擦拭顯微鏡臺表面進行消毒。
6)打開培養容器,將外植體接種到培養基上。如果使用的是玻璃培養容器,把瓶口置酒精燈火焰上烘烤數秒鐘,然后迅速用瓶蓋或封口膜封嚴。

 


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