質粒構建以及需要注意的事項

1。載體構建
載體構建(vectorconstruction)：載體構建是分子生物學研究常用的手段之一。主要包括已有載體多克隆位點（MCS）的改造和已有載體啟動子、增強子、篩選標記等功能元件的改造。是為把DNA分子運送到受體細胞中去，必須尋找一種能進入細胞、在裝載了外來的DNA片段后仍能照樣復制的運載體。理想的運載體是質粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工構建的質粒作為載體。載體構建即是構建含外源DNA的質粒。 特點：當給質粒插入一段外源DNA片段后，它依然能夠進行自我復制。

2。多克隆位點
多克隆位點（multiple cloning site, MCS），指的是包含數個（最多20個）限制性酶切位點（restriction site）的一段很短的DNA序列。也稱為多位點接頭（polylinker），是基因工程中常用到的載體質粒的標準配置序列。MCS上含有多個單一酶切位點，是外源DNA的插入部位，每個限制性酶切位點通常是的，即它們在一個特定的載體質粒中只出現一次。不同酶的酶切位點可有重疊。單一酶切位點就是只有一種特定的酶能夠識別并進行酶切的位點，多克隆位點一般是位于質粒上的一段序列，這段序列含有很多個酶切位點，但這些酶切位點每一個都被一種酶識別并酶切。

3。質粒構建
（1）質粒構建原理
質粒構建是分子生物學研究中最常用的實驗技術。原理依賴于限制性核酸內切酶，DNA連接酶和其他修飾酶的作用，分別對目的基因和載體DNA進行適當切割和修飾后，將二者連接在一起，再導入宿主細胞，實現目的基因在宿主細胞內的正確表達。
（2）質粒構建方式
質粒構建方式多樣，常規的T4連接酶，下面就介紹下T4連接酶構建質粒方法，T4連接酶可用于平末端也可用于粘性末端連接，但一般推薦適用黏性末端。
（3）質粒載體的制備
質粒載體的制備既可以選擇單酶切也可以選擇雙酶切，一般推薦使用雙酶切。其實目的就只有一個，盡量使載體的末端具有特異性，防止自連。

4。雙酶切
將目的基因重組入質粒構建時選擇酶切（這里是指雙酶切）位點應注意幾點：
（1）選擇質粒上兩個酶切位點的距離不應小于太小（>10bp），否則影響限制性內切酶對切點的識別，不利于空載體的雙酶切。
（2）一般目的基因用于克隆表達的情況下，酶切位點的選擇要考慮到：
目的基因片段內部不含有所選的酶切位點（不然鑒定陽性重組子雙酶切時會將目的基因切斷）。
（3）實驗后繼應用的所有載體（真核、原核、酵母、昆蟲）都盡可能含有所選的酶切位點。并且要保證在載體上的插入方向正確（定向克隆）。（不然換載體表達時，還要重新設計引物，以引進新的酶切位點）。
（4）盡可能選比較常用的酶切位點（常用切點酶的價格比較便宜）。
（5）兩個酶切點至少隔上3個堿基。
（6）兩個酶切點更好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補），否則效果相當于單酶切。
（7）更好使用酶切效率高的酶。
（8）更好使用雙酶切有共同buffer的酶。
注：質粒構建完成后可利用PCR原理進行測序驗證。