1.熒光

當(dāng)某種物質(zhì)受到波長較短的光波照射時(shí),會(huì)發(fā)射出波長較長的光。若切斷照射光后仍能發(fā)光,稱之為磷光；若照射停止后光立即熄滅,這種光稱之為熒光。熒光發(fā)光機(jī)理可按量子理論通俗解釋: 光具有波動(dòng)、粒子二重性,光波愈短,其光子能量愈強(qiáng)；反之波長愈長其能量則弱。當(dāng)某些物質(zhì)受到紫外線或較短波長光照射,吸收了全部或部分光能量,使其分子的能級升高而處于亞穩(wěn)定狀態(tài),當(dāng)恢復(fù)到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí),這些分子就會(huì)立即釋放多余的能量,其中一部分化為熱量而消失。但對某些物質(zhì)而言,向基態(tài)躍遷時(shí)是以“光”形式釋放,因?yàn)橛胁糠帜芰勘幌?所以重新發(fā)出的光能量總比吸收的能量要小。由于能量愈小,光波愈長,所以物質(zhì)所激發(fā)的熒光總比照射它的光波要長。

磷光的能量較熒光還要小,所以它的波長比熒光要長,壽命可達(dá)數(shù)小時(shí)之久,這就是兩者的區(qū)別。激發(fā)物質(zhì)發(fā)出熒光的照射光稱之為激發(fā)光,也是該物質(zhì)吸收光,它的光譜包含紫外線、藍(lán)光,現(xiàn)已擴(kuò)展到黃綠光波段。熒光光譜色隨物質(zhì)的差別和所用熒光色素的不同也有區(qū)別。它的光譜與可見光一樣,紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫全有,有的物質(zhì)標(biāo)本只有一種顏色熒光,但有的有多種顏色熒光。

熒光可分為自然熒光和人工熒光兩種：

自然熒光(或稱一次熒光、自發(fā)熒光、自體熒光和原發(fā)熒光): 某些物質(zhì)勿需經(jīng)過處理,當(dāng)受到激發(fā)光照射就能產(chǎn)生熒光的稱為自然熒光。如植物的葉子、莖；動(dòng)物的一些組織:牙齒、骨質(zhì)、爪甲、白頭發(fā)、尿液、血漿及維生素等；某些結(jié)晶體、有機(jī)化合物、合成物、油類、蛋白質(zhì)、臘等。所以自然熒光在造紙、纖維、染料、化學(xué)藥品、食品和油脂等工業(yè)方面被用作檢查和鑒別。在環(huán)保中對大氣污染公害的監(jiān)測中也用紫外線進(jìn)行粉塵熒光觀測。

熒光顯微鏡初期就用于觀察動(dòng)、植物標(biāo)本的自然熒光。

人工熒光(或稱二次熒光、繼發(fā)熒光、染色熒光): 某些物質(zhì)必須經(jīng)過化學(xué)處理,如用染料——熒光色素與其結(jié)合,才能在激發(fā)光下發(fā)射熒光。所謂熒光色素是一類能產(chǎn)生明顯熒光,并能作為染料使用的有機(jī)化合物,它有天然和人工合成兩類,后者常用的有數(shù)十種之多,如吖啶橙、羅達(dá)明等。熒光色素也叫作熒光染料,這樣非熒光試樣通過有選擇的熒光色素進(jìn)行染色后,在熒光顯微鏡下就可從顏色和反差中清晰地分辨其中不同的細(xì)胞組織。染色熒光方法在細(xì)胞化學(xué)和組織化學(xué)中很早就應(yīng)用了,如用鹽基黃(Auramine)對結(jié)核菌染色是常見的。

免疫熒光是利用抗原抗體能進(jìn)行特異性結(jié)合的免疫化學(xué)特性,以熒光色素標(biāo)記已知的抗體(或抗原)作為試劑,在特定條件下檢測未知的抗原(或抗體)。借助于熒光顯微鏡觀察抗原抗體結(jié)合物的熒光現(xiàn)象,從而可對抗原抗體物質(zhì)進(jìn)行定性、定位觀察。此技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)多種領(lǐng)域之中,并在標(biāo)準(zhǔn)化、定量化、自動(dòng)化三方面達(dá)到較先進(jìn)水平。免疫熒光也稱為熒光抗體法,它在1950年由美國生物學(xué)家D.Coo ns試驗(yàn)成功,并獲得諾貝爾獎(jiǎng)。幾十年來在細(xì)菌學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)、免疫病理學(xué)、寄生蟲學(xué)、腫瘤學(xué)方面得到應(yīng)用。熒光在農(nóng)業(yè)科學(xué)、生物學(xué)、古生物學(xué)、獸醫(yī)學(xué)等方面也獲得廣泛應(yīng)用。

2. 熒光的特性

歸納起來,熒光具有以下特性：

(1)物質(zhì)欲發(fā)射熒光,必須吸收激發(fā)光能。在常溫下所發(fā)出的熒光波長較激發(fā)光長,能量較激發(fā)光弱(Stokes定律)。

(2)熒光的吸收光譜和發(fā)射光譜大致對稱于某軸分布,形成鏡象關(guān)系,它的吸收光波段A和發(fā)射光波段B大約在150nm范圍內(nèi),之間的峰值距C則隨物質(zhì)而異,更大相距約為180nm,小的約為30nm ,但大多數(shù)激發(fā)光譜長波部分常常與發(fā)射光譜短波部分重疊在一起。

FITC的吸收和發(fā)射光譜曲線

物質(zhì)熒光的光譜特性是固有的,當(dāng)它接收特定的激發(fā)光(吸收),就會(huì)發(fā)出固有熒光色,因此依據(jù)熒光的特異性可判斷是什么物質(zhì)。

(3)熒光發(fā)出時(shí)不象普通光那樣會(huì)產(chǎn)生熱效應(yīng),它是冷光。熒光隨激發(fā)光停止照射時(shí),在10-7 s～10-8 s間內(nèi)消失。

(4)熒光發(fā)光方向與激發(fā)光的方向無關(guān),它呈球體輻射。

(5)熒光的衰減與猝滅。熒光的衰減是指在受激發(fā)光照射期間,發(fā)出的熒光光強(qiáng)的減弱。衰減的程度取決于激發(fā)光強(qiáng)度和照射時(shí)間。采用高強(qiáng)度激發(fā)光時(shí)其衰減要顯著得多,有時(shí)在1秒的間隔內(nèi),熒光就會(huì)大大減弱。熒光還有猝滅現(xiàn)象,特別對于繼發(fā)熒光,這是一種復(fù)雜的現(xiàn)象,由于處于激發(fā)狀態(tài)的熒光發(fā)色團(tuán)分子發(fā)生了變態(tài),導(dǎo)致熒光量子產(chǎn)量的減少,這樣便縮短了熒光的發(fā)射。

(6)熒光的光強(qiáng)I熒一般是較弱的,熒光效率約在0.1～ 0.9之間,通常只在0.3～0.4。它由下式?jīng)Q定

I熒 = R × Z

R——吸收光強(qiáng),它僅占光源能量的一小部分；Z——小于1的系數(shù)。

(7)熒光具有偏振性

表1列舉了常用的熒光色素的平均吸收波長、熒光平均波長和峰值間隔。表中數(shù)值可用顯微光度計(jì)或分光光度計(jì)和熒光光度計(jì)在熒光色素染色標(biāo)本上測定。

測定物質(zhì)的吸收光譜和熒光光譜是非常重要的,特別對于新的色素必須測定。所測數(shù)據(jù)以文件形式記錄,可作為設(shè)計(jì)熒光顯微鏡的基本依據(jù)。

3. 熒光顯微鏡

熒光顯微鏡是熒光顯微檢測的專用工具,它是光學(xué)顯微鏡的一種。它除了具有光學(xué)顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和光學(xué)放大作用外,基于熒光的特性,還具備以下獨(dú)特的功能要求:

(1)提供足夠能量的能激發(fā)出熒光的光源。

(2)有著適應(yīng)不同物質(zhì)所需的激發(fā)光譜一組濾色片,從光源中選擇合適的激發(fā)光譜,使析出的光譜與該物質(zhì)的吸收光譜重合,以期望獲得更大的熒光。

(3)為獲得較弱的熒光圖像,還要建立一套截止濾色片,它使所需觀察的熒光進(jìn)入系統(tǒng)成像,而將其余的光波,包括發(fā)射光阻擋在外,用來提高圖像的襯度。

(4)放大的光學(xué)系統(tǒng)應(yīng)適應(yīng)熒光的特性,最終獲得既能觀察又能攝影的高亮度、高分辨力的良好襯度的熒光圖像。

(5)儀器的安全性。應(yīng)用汞燈要防止紫外線的泄漏和汞燈的爆炸,保證電器安全。

4. 熒光顯微鏡的光源

熒光顯微鏡光源的選擇取決于所需檢測的熒光物質(zhì)的吸收光譜,從表1中可見,熒光色素的平均吸收波長峰值從紫外(340nm)到黃綠光(595nm)。具有這些光譜的強(qiáng)光源有超高壓汞燈、超高壓氙燈和大功率的鹵素?zé)簟３邏汗療羰菬晒怙@微術(shù)中最常用的光源,它是利用金屬汞蒸汽在超高壓下放電發(fā)光原理制成的。光度極強(qiáng),可達(dá)2×108 cd/m2～3×108 cd/m3,發(fā)光光譜為280nm～600nm,具有不連續(xù)的線條光譜特性,有的波段特別明亮。下圖是HBO—200W光譜能量分布,在紫外（UV)區(qū)有296.6nm、302.3nm、312.5nm、313.2nm、 334nm和365nm等波峰,其中365nm是最強(qiáng)的峰值,也是應(yīng)用最廣的紫外激發(fā)光。其次在藍(lán)光區(qū)(B)有404.7nm和407.8nm及434.8nm～435.3nm峰值,綠光(G)區(qū)中有546.1nm和黃光區(qū)(Y)577nm,它用于激發(fā)羅達(dá)明B200的光源。

HBO—200W發(fā)射光譜曲線

超高壓汞燈(HBO)發(fā)光時(shí),泡內(nèi)產(chǎn)生50～70個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓,它的引燃電壓很高,工作時(shí)維持電壓較低,約為50V～60V,電絲電流在4A左右,燈的壽命與啟動(dòng)次數(shù)和工作時(shí)間有關(guān)。啟動(dòng)次數(shù)愈多,每次工作時(shí)間愈短,壽命愈短。生產(chǎn)廠在出廠時(shí)應(yīng)給出規(guī)定平均壽命,如德國萊茨公司規(guī)定每啟動(dòng)一次工作3h,共啟動(dòng)70次為準(zhǔn),平均壽命為200h；日本奧林巴斯公司平均壽命是400h。使用中,當(dāng)燈泡變黑或達(dá)規(guī)定時(shí)間應(yīng)調(diào)換燈泡 ,否則除了燈的光度下降外,而且還有可能出現(xiàn)爆炸事故。熄滅時(shí)一般約15分鐘方完全冷卻,在未完全冷卻時(shí),切勿打開燈室,因熱燈泡內(nèi)壓力很大,聚冷會(huì)引發(fā)爆炸。因此在說明書上應(yīng)予強(qiáng)調(diào)并要求統(tǒng)計(jì)使用時(shí)間 ,填寫記錄,注意安全。

超高壓氙燈(XBO)是利用惰性氣體在超高壓(30個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓)下放電發(fā)光原理制成的。它的發(fā)光光譜與太陽光譜相近,是連續(xù)光譜,波峰在400nm～450nm之間,光譜較平緩,而且有豐富的連續(xù)紫外線,是良好的紫外和藍(lán)光激發(fā)光源,它的光度也極強(qiáng),如XBO—75W的光度在1.5×108 cd/m2～4×108 cd/m2之間,它的色溫在 6000°K以上,是日光的色溫,所以是彩色攝影極好的照明光源。其優(yōu)點(diǎn)是操作方便,啟動(dòng)立即點(diǎn)燃,點(diǎn)燃后即使立即熄滅,也不會(huì)損壞燈泡,壽命很長。發(fā)光過程中,弧光穩(wěn)定,色溫不變,其缺點(diǎn)是需專用的低壓直流電源箱,燈的溫度極高,價(jià)格比汞燈更為昂貴。

鹵素?zé)羰窃谑魵?nèi)充入鹵族元素溴或磺,充溴的叫溴鎢燈,能發(fā)出強(qiáng)烈的連續(xù)可見光譜,它的體積小,重量輕,價(jià)格更便宜,適用不需要紫外線激發(fā)的熒光顯微鏡中作激發(fā)光源。如醫(yī)院中用FITC(異硫氰酸熒光黃)進(jìn)行常規(guī)診斷時(shí),需要藍(lán)光490nm波段激發(fā)時(shí),用12V 100W鹵素?zé)艟秃芎线m。

光源選擇其次要考慮它的功率,選用大功率還是低瓦數(shù)的燈泡? 原則上講應(yīng)盡可能選用低瓦數(shù)的光源,無疑這對結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和成本是有利的。但過低的瓦數(shù)在激發(fā)時(shí)不能激發(fā)出熒光或發(fā)出熒光不穩(wěn)定,就不能使用 了。而能否激發(fā)出熒光又與整個(gè)成像系統(tǒng)的光能利用相關(guān),能充分合理有效地利用光能,瓦數(shù)就可以降下來,單純地追求大功率光源作為熒光檢測并不可取,還會(huì)引發(fā)熒光的衰減和猝滅。當(dāng)前供應(yīng)的落射熒光顯微鏡僅配備100W的汞燈或氙燈和鹵素?zé)簟?/p>

在選擇光源時(shí),還需注意到弧光尺寸,即光源發(fā)光區(qū)的大小。如汞燈50W 弧光尺寸為1.0×0.3mm,200W為2.2×0.5mm,而100W為0.25×0.25mm。能否正好充滿系統(tǒng)的入瞳使光能充分利用,對一個(gè)優(yōu)良的熒光顯微鏡,各種倍率的物鏡“光能”皆可充分有效的利用是一個(gè)值得關(guān)注的指標(biāo)。

在熒光顯微鏡設(shè)計(jì)中,光源選擇在總體設(shè)計(jì)中是至關(guān)重要的,它決定了儀器的使用范圍和成本,也反映了儀器的檔次。實(shí)驗(yàn)室以上的顯微鏡應(yīng)以汞燈為主光源,簡易型(專用)的顯微鏡則以鹵素?zé)魹橹鞴庠础?/p>

5. 熒光顯微鏡濾色片

濾色片是熒光顯微鏡的關(guān)鍵部件,在熒光顯微鏡中按其功能可分為激發(fā)濾色片和截止濾色片兩類。激發(fā)濾色片的功能是從光源中分析出所需的特定光譜,以激發(fā)標(biāo)本產(chǎn)生熒光。截止濾色片的功能是僅把標(biāo)本上發(fā)出的熒光透過成像,而將其它光阻擋不參與成像,一般激發(fā)濾色片安置在緊靠光源,而截止濾色片在物鏡與目鏡之間，按其透過光譜特性曲線可分為“短波通過”、“長波通過”和“波段通過”濾色片。波段通過濾色片按波帶寬度又可分為“寬波帶”和“窄波帶”濾色片,如果半寬帶(即HW=50%的透射峰的主透射帶的寬度之半)大于50nm,視為“寬波帶型”；若小于20nm,則可視為“窄波帶型”。

濾色片初期用貯放玻璃盒中的有色液體,后改用帶色膠質(zhì)片,由于易變色和使用不方便已被淘汰。現(xiàn)在經(jīng)常使用的為色玻璃和干涉濾色片,色玻璃大都屬寬波帶濾色片,透過波段寬,透過率隨厚度而降低,價(jià)格相對低廉。由于色玻璃與空氣的界面上,約有4%光線被反射掉,玻片愈多,光能損失愈大,限制了它的使用性能。干涉濾色片的出現(xiàn),可按需要制成能透過或截止一定波段的濾色片,從而促使熒光顯微術(shù)的進(jìn)展,現(xiàn)代技術(shù)上已能對某波段的透射率或反射率進(jìn)行控制。

從表1可見,多數(shù)熒光色素和熒光發(fā)色團(tuán)分子具有相當(dāng)寬的吸收光波帶和熒光波帶,峰值間隔又較大,所以需要得到強(qiáng)熒光時(shí),很少使用窄波帶濾色片,因?yàn)樗率瓜喈?dāng)大的光源能量損失了(沒有利用),僅在光源的強(qiáng)發(fā)射譜線和激發(fā)時(shí)的吸收峰相重合時(shí)才使用。當(dāng)使用寬波帶濾色片時(shí),往往組織成分和光路中的自發(fā)熒光會(huì)被這類濾色片中的短波光激發(fā)出來,加到熒光圖象中而混擾。多數(shù)應(yīng)用中,激發(fā)濾色片的半寬約20nm就能給出滿意的結(jié)果。

用濾色片(色玻璃和干涉濾色片)選取光源中的部分光譜段以獲得熒光物質(zhì)的激發(fā)光以及發(fā)揮相應(yīng)的截止作用從原理上講是完全可以的,但不可能配備那么多濾色片去適應(yīng)所有的熒光物質(zhì)的需要。如何建立最小的濾色片系列,組合后使之滿足各種不同的要求,這是設(shè)計(jì)者必須要認(rèn)真權(quán)衡的問題。除了功能考慮外,還要注意成本和濾色片壽命。色玻璃和干涉濾色片價(jià)位比,目前相差百倍,一些軟膜干涉濾色片的壽命僅兩年有效。因此設(shè)計(jì)者必須關(guān)注“用戶”需要,經(jīng)常使用那些熒光色素,對于特殊要求的可作為選用件特殊處理。

對于激發(fā)濾色片一般按激發(fā)光譜分為: 紫外區(qū)(UV)波段在340nm～380nm,小于400nm；紫/藍(lán)區(qū)(V)波段在390nm～460nm；藍(lán)光區(qū)(B)波段在460nm～500nm；綠光區(qū)(G)波段在500nm～570nm,目前還有黃光區(qū)(Y)波段在570nm～595nm之間,各廠家在各激發(fā)區(qū)內(nèi)還進(jìn)行細(xì)分。細(xì)分的原則是按不同的激發(fā)波帶寬度和峰值,如在B激發(fā)中分為400nm～490nm；420nm～490nm；450nm～490nm；465nm～495nm和470nm～490nm 5種。

6. 顯微鏡的光學(xué)成像系統(tǒng)

熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)必須完成兩個(gè)主要功能:

(1)要有效地激發(fā)試樣中熒光反應(yīng)物,使用的發(fā)射波長更好接近它的吸收峰；

(2)必須盡可能多地收集發(fā)出的熒光,以便使顯微鏡內(nèi)可見度最合適。

熒光光學(xué)系統(tǒng)的成像質(zhì)量主要取決于像的襯度和像的亮度,像的襯度是由樣品中激發(fā)出的熒光與背景上觀察到的光之比決定的。背景光包括透過截止激發(fā)光的濾色片的雜散激發(fā)光,樣品組織成分的自發(fā)熒光和光學(xué)系統(tǒng)的自發(fā)熒光和雜散光,在熒光顯微術(shù)中盡全力要解決的是既獲得更佳的像襯度,同時(shí)又維持像有足夠亮度,這兩者往往是矛盾的。例如用極窄波帶濾色片激發(fā)時(shí)僅利用了極少的光能,背景暗了但熒光亮度也弱了。在應(yīng)用時(shí),只能兼顧,合理的權(quán)衡以決定取舍。

熒光顯微光學(xué)系統(tǒng)需要優(yōu)先考慮的是:

(1)光學(xué)系統(tǒng)組成的材料應(yīng)選用在激發(fā)光波內(nèi)無熒光材料,不但指光學(xué)系統(tǒng)玻璃也包括膠合制造中的膠合劑、切片、蓋玻片和浸液以及密封劑。若有自發(fā)熒光,不但會(huì)增加背景光,有時(shí)還會(huì)混淆觀察熒光圖像。

(2)光學(xué)系統(tǒng)的參數(shù)選擇中,應(yīng)將獲得更大光能作為考慮因素。

照明系統(tǒng)中集光鏡應(yīng)選用更大的包容角；采用柯勒照明并使燈絲或弧光像充滿入瞳,以期望獲得率的均勻照明。

收集熒光成像的物鏡,因?yàn)橄衩嬲斩扰c數(shù)值孔徑 NA2成正式,為此作為熒光用物鏡應(yīng)有較大的NA值。目前10×已達(dá)0.5；20×達(dá)0.75；40×達(dá)0.9；油鏡40×達(dá)1.3。

雙目鏡筒作為熒光用時(shí)應(yīng)在可見光譜段有較高的透過率,采用鍍膜技術(shù)可大大地減少光能的損失,它可比一般雙目鏡筒透射率提高一倍,這對弱熒光物質(zhì)觀察是必須的。

(3)作為熒光光學(xué)系統(tǒng)各組成部件的光譜特性也是至關(guān)重要的,特別是紫外光要通過的部件,如照明系統(tǒng),聚光鏡以及物鏡,要關(guān)注紫光區(qū)的透射系數(shù)。聚光鏡要選用透紫外線的材料。照明系統(tǒng)中反光鏡表面鍍鋁比鍍銀好,因?yàn)殇X在UV和V區(qū)反射率在90%以上,而銀僅達(dá)70%。加拿大膠吸收紫外線,在紫外區(qū)通過處不宜用作膠合劑。