水母發(fā)光物質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)

一、水母發(fā)光蛋白
水母的整體或分離出的顆粒是發(fā)綠光的。
科學(xué)家首先從多管水母身上分離出了水母發(fā)光蛋白(aequorin),其分子量為20kDa,aequorin是水母熒光素(coelenteragine,結(jié)構(gòu)如下)通過硫酸酯鍵或過氧化鍵緊緊地連到脫輔水母發(fā)光蛋白( apoaequorin)上形成的。

它遇到鈣離子發(fā)藍光,因此可以作為鈣離子的檢測試劑,發(fā)光后的產(chǎn)物是脫輔水母發(fā)光蛋白,CO2和氧化熒光素(colenteramide)

二、綠色熒光蛋白(GFP)
一種天然的納米粒子(圖2),大約8~10nm,呈圓筒形折疊。 在晶體中或在離子強度低于100mmol/L的溶液中兩個原體形成二聚體。二聚對于GFP的激發(fā)和能量傳遞是有作用的。 圓筒外邊11條鏈形成結(jié)構(gòu)的外壁。圓筒直徑3nm長4nm。

α-螺旋小的片段在圓筒的末端形成筒,一個不規(guī)測的α-螺旋片段作為一個支架可以提供給發(fā)色團,使其坐落在圓筒的中心。β-片層狀的鏈彼此牢牢地固定,像支撐桶的棒。結(jié)構(gòu)形成一個密集體,沒有開口。這種折疊的模式是β-片層狀在外,α-螺旋在內(nèi),是一種新的蛋白類型,命名為β-罐( beta-can）。

圖3給出了GFP折疊的布局。
從 C-末端除去多于7個的氨基酸或者從N-末端除去帶蛋氨酸的片段就沒熒光了,沒熒光的變異就不會表現(xiàn)出整個發(fā)色團的吸收光譜特征。最后的7個殘基無序,在圓筒的外邊彎回來,不構(gòu)成筒的外壁,它們的存在不是必需的,另外再加一些殘基也沒關(guān)系。至于N-末端,在圓筒內(nèi)的條蛋白鏈開始于殘基10,筒的形成不需要N-末端部分。N-末端片斷是在蛋白的一頭的帽子的主要成分,是折疊的,可以保護發(fā)色團。
在N-末端延伸不會破壞蛋白的結(jié)構(gòu)。非常緊密牢固的筒狀結(jié)構(gòu)和發(fā)色團所處的中心位置,都可以說明發(fā)色團被嚴(yán)格保護,性質(zhì)穩(wěn)定。
 
GFP由238個氨基酸組成,分子量約28kDa,組成發(fā)色團蛋白的3個殘基 Ser-dehydroTyr-Gly( 絲-脫氫酪-甘)位于65~67位,經(jīng)共價鍵連接而成對羥苯甲基咪唑烷酮,它可以被光激發(fā)產(chǎn)生熒光(圖式2) 。

雖然氨基酸序列Ser-dehydroTyr-Gly在不少蛋白中也存在,但不是環(huán)化的,酪氨酸也不是被氧化的,更不會發(fā)光。說明能形成發(fā)色團不是這三肽的固有特性。
在GFP中,發(fā)色團的形成經(jīng)系列自催化過程,既無輔助因子也沒有酶介入。首先是 Ser65 和 Gly67 快速環(huán)化形成咪唑啉-5-酮中間體,然后O2慢慢氧化Tyr66的側(cè)鏈,這個過程要幾個小時(圖式3)。形成發(fā)色團需要Gly67,沒有任何一個氨基酸可以取代Gly。反應(yīng)對熱敏感,溫度高于30℃時產(chǎn)率下降。一旦形成GFP,它就是熱穩(wěn)定的。

GFP的發(fā)色團很穩(wěn)定,用酸、堿、鹽酸胍使蛋白變性,一旦恢復(fù)中性或除去變性劑,又可以恢復(fù)發(fā)光性能。

熒光蛋白的歷史
20世紀(jì)
1962年綠色熒光蛋白（GFP）被發(fā)現(xiàn)，下村修等人在一種學(xué)名為Aequorea victoria的水母中發(fā)現(xiàn)GFP，科學(xué)家在海洋珊瑚蟲中分離得到了第二種GFP，研究者們未意識到GFP的應(yīng)用前景，GFP獨坐冷宮20年
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1992年
克隆并測序了野生型GFP，普瑞舍克隆并測序了野生型的GFP綠色熒光蛋白，文章發(fā)表在《Gene》雜志上，基金評審委員會認為普瑞舍的工作沒有意義，不愿提供經(jīng)費
普瑞舍一氣之下，離開了科學(xué)界，將GFP的cDNA送給了幾個實驗室，很多人嘗試用GFP的基因來表達蛋白，但都失敗了，馬丁?查爾非用PCR的方法擴增了GFP的編碼區(qū)得到真正的突破

1995年完成單點突變研究者RP爆發(fā)，獲得高亮度GFP綠色熒光蛋白。
1996年發(fā)布GFP的晶體結(jié)構(gòu)，不知道為什么晶體結(jié)構(gòu)發(fā)布地這么晚

1999年發(fā)現(xiàn)橙紅色的熒光蛋白同源物
人們在銀蓮花中發(fā)現(xiàn)了橙紅色的熒光蛋白同源物，稱之為DsRed（發(fā)射峰在583 nm）
DsRed紅色熒光蛋白的出現(xiàn)讓研究人員認識到熒光蛋白的多樣性，同時也有了更豐富的改造模板
更長波長的熒光蛋白也陸續(xù)出現(xiàn)，如 mStrawberrymCherry（2004） mApple（2008） mRuby（2009）

21世紀(jì)
2007年培育出一種深紅色的熒光蛋白質(zhì)
來自莫斯科的 研究人員培育出一種穿透性超強的深紅色的熒光蛋白質(zhì)
研究員Chudakov的一個同事在逛寵物商店時發(fā)現(xiàn)了一只顏色深紅的海葵
出于職業(yè)的直覺，他將海葵帶了回來，經(jīng)過誘變，得到能在生物體內(nèi)穩(wěn)定存在并能發(fā)出更明亮紅光的蛋白質(zhì)，Chudakov已在人體細胞和青蛙身上測試了這種新的熒光蛋白質(zhì)
斯坦福大學(xué)分子影象中心的科學(xué)家如是評價： Chudakov培育出的這種深紅色熒光蛋白質(zhì)將大大提高生物體活體成像的質(zhì) 量，并在實時追蹤活生物體內(nèi)深層組織的分子活動上得到廣泛的應(yīng)用 ！