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植物學碩士與GFP的愛恨情仇

作者:生命科學事業部時間:2019-12-02 08:33:29瀏覽2565 次

信息摘要:

一個植物學碩士生和GFP的愛恨情仇

依稀記得那是一個陽光明媚的午后,導師把我叫到幽暗的辦公室,臉上帶著謎一般的微笑看著我。那一瞬間我的瞳孔放大,內心忐忑,當下只想導師看不見我,然后以光速轉身離開至導師的視線范圍外。可現實是真的殘酷啊!常話說得好,事出反常必有妖(苦笑ing)。“最近實驗做的怎么樣呀?基本實驗技能都掌握的不差了吧!”“挺……挺好的,該學的都學了……”“我有一個想法,你看我們給xx蛋白融合GFP后是不是就可以追蹤它在植物活體內的轉移情況了?”從此,我與GFP演繹了一場的愛恨情仇狗血劇。
“師兄,你有沒有構建過帶GFP標簽的基因表達載體啊?”“Of course!GFP這么小,很容易裝進去的,你只需要如此……再這樣……” “但我的目的基因有9k。”“打擾了,告辭。”嘴上說著不要,身體卻很誠實。最終,嘗盡各種方法,歷時整整半年,我成功將融合GFP的目的基因通過多片段重組裝入表達載體。我本屬于這個世界,在那一刻,我覺得全世界都屬于我(哈哈哈~哈哈~哈~~~)。
可好景不長,我的宇宙神話泡泡僅堅持了100h就被無情戳破了。我發現葉片上注射農桿菌的部位確實能觀測到GFP熒光,但無法成功實現對蛋白的轉移追蹤,植株非注射葉片中呈現給我的只有一片黑暗,正如我的心情一樣(送上一首涼涼給自己),當場自閉。隨后,導師在聽完我匯報后意味深長地說:“你有沒有看過文獻,別人將GFP融合在xx同源蛋白的N端還是C端,或者其他位置呢?GFP的融合位置對蛋白的表達和轉移可能有影響。”從此以后,我明白了實驗前大量閱讀相關文獻以及與導師溝通的必要性(一臉認真)。
歷史性的一刻終于到來啦!我在植株非注射葉片上觀測到蛋白轉移后的GFP熒光了。

GFP在顯微鏡下的熒光

 
“你以為這樣就結束了嗎?”導師再次意味深長地的看著我。“你要拍怎樣的照片去證明你蛋白的轉移呢?”說完給了我一個高深莫測的背影緩緩離去。留下一頭霧水的我,我當下拍上了日漸掉發的腦門兒,意識到熒光顯微鏡的圖像無法直觀體現出對GFP標簽蛋白轉移的追蹤。我又默默地轉過頭看著取樣后破破爛爛的植株,淚,再次流了下來(em……是咸的)……
事后我又從文獻中了解到利用高強度紫外光源照射植株體即可激發GFP熒光,且可以在對樣本零破壞的情況下實現對植株活體全局的熒光觀測,直觀追蹤熒光蛋白表達。而正巧本實驗室就有這么一臺高強度紫外光源。“當上帝關了這扇門,一定會為你打開另一扇門”《圣經》誠不欺我。然而,上帝可能因為網絡延遲問題沒能及時收到我的求助,紫外燈下我的植株只能看到葉片上的點點繁星(其實是灰塵),我的綠色熒光吶!

紫外線燈下的煙草 
百般無奈之下,只好拿出我玩英雄聯盟的專注度,歷經一整夜在x度,xx通,xx蟲上的奮戰后,感謝上帝給我安排的天使終于到來啦!她耐心的為我解答了我的所有疑惑。知悉天然GFP有多個吸收峰,更大和次大的激發波長分別是395nm和475nm,紫外光和藍光均可激發熒光。而我構建載體所用為增強型綠色熒光蛋白(eGFP),即GFP的第64位的苯丙氨酸置換成亮氨酸,第65位的絲氨酸置換成蘇氨酸。EGFP在488nm的藍光激發下產生波長為517nm的綠色發射光,其熒光強度是同條件下GFP的35倍多,但紫外光源無法激發熒光。恍然大悟的我啪的一下,歷盡千辛萬苦終于向上帝要來了天使小姐姐微信二維碼,為熒光蛋白發愁的小伙伴們我只能幫你們到這里咯!


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煙草的GFP在LUYOR-3415RG照射下發出綠色熒光

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