如何快速觀察到EGFP在動(dòng)植物體內(nèi)的表達(dá)？

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EGFP在煙草上的表達(dá)

EGFP--Enhanced green fluorescent protein.

egfp熒光蛋白的激發(fā)光波長(zhǎng)和egfp熒光波長(zhǎng)光譜圖如下：

EGFP熒光蛋白的激發(fā)光主峰為488nm，EGFP熒光蛋白的熒光波長(zhǎng)為510nm。

常用的熒光蛋白有哪些？

GFP變體
BFP–Blue-藍(lán)色熒光蛋白
CFP–藍(lán)綠色熒光蛋白
GFP–原綠色熒光蛋白
EGFP–紅移激發(fā)的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白
EYFP–增強(qiáng)型黃色熒光蛋白
PA-GFP–光活性綠色熒光蛋白

非Aequorea victoria水母來(lái)源的FP
dsRed–珊瑚源熒光蛋白
mFruits–dsRed突變體
mCherry–常見的紅色熒光蛋白
TagRFPs–Evrogen的全光譜FP系列
eqFP611–分離自拳頭海葵(Entacmaea quadricolor)
Dronpa–光開關(guān)熒光蛋白
EosFP–光轉(zhuǎn)換熒光蛋白

EGFP和GFP熒光蛋白的區(qū)別是什么？

eGFP是增強(qiáng)型綠色熒光蛋白，由野生型熒光蛋白通過(guò)氨基酸突變和密碼子優(yōu)化而來(lái)。eGFP而言，相對(duì)于GFP，其熒光強(qiáng)度更強(qiáng)、熒光性質(zhì)更穩(wěn)定。同時(shí)載體中構(gòu)建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)效率更高。

EGFP為什么是更好的選擇？

增強(qiáng)型GFP或EGFP這款熒光蛋白為單體、明亮、表現(xiàn)良好、無(wú)侵入性且?guī)缀醪粫?huì)失效，其已經(jīng)過(guò)反復(fù)驗(yàn)證，因此無(wú)論您選擇何種生物體或應(yīng)用，EGFP都是最理想的選擇。
與此相反，如果您需要通過(guò)紅色通道成像，則mCherry是最理想的選擇。眾多參考文獻(xiàn)中提及了很多紅色的FP，但是迄今還沒(méi)有任何其他FP比mCherry的發(fā)表文獻(xiàn)數(shù)目更多，比mCherry更適合Texas Red濾光片光立方。

BFP藍(lán)色熒光蛋白熒光強(qiáng)度怎么樣？

Venus是一種極其明亮的單體黃色FP，但其并不能很好地適應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡濾光片組，因此在您使用Venus時(shí)難免要在捕捉信號(hào)方面耗費(fèi)很多的精力，盡管該光譜的藍(lán)色末端很具吸引力，但坦白來(lái)講，除非您的靶標(biāo)豐度超高，否則您不想使用大多數(shù)的藍(lán)色FP，這是因?yàn)檫@一類FP所發(fā)出的熒光遠(yuǎn)較EGFP或mCherry微弱。

GFP熒光蛋白表達(dá)量很低的原因是什么？

最令人沮喪的事情莫過(guò)于，千辛萬(wàn)苦將自己的融合蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)入到細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GFP表達(dá)水平很低甚至沒(méi)有表達(dá)。導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平很低的因素包括與宿主生物體適應(yīng)性很差的啟動(dòng)子、靶蛋白融合與GFP折疊的位阻效應(yīng)，以及多聚體亞單位的表達(dá)（注定要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)終止），甚至克隆錯(cuò)誤。

如果您是要了解GFP的激發(fā)光波長(zhǎng)，請(qǐng)點(diǎn)擊下面鏈接：

GFP的激發(fā)光波長(zhǎng)和GFP的發(fā)射光波長(zhǎng)

EGFP是GFP突變系

(1)RedShifted(紅偏移)GFP突變系(EGFP & GFPS65T)
  色基發(fā)生了氨基酸取代，λmax(Excitation)偏移至490nm附近。紅偏移突變系的更大激發(fā)峰都落在常用濾色片的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，所以獲得的熒光信號(hào)要比wtGFP明亮得多。同樣，F(xiàn)ACS和共焦顯微鏡的氬離子光源的發(fā)射波長(zhǎng)為488nm，對(duì)RedShifted突變系的激發(fā)效率也明顯高于wtGFP。EGFP發(fā)生了雙氨基酸取代，Leu(亮氨酸)取代Phe64(苯丙氨酸)，Thr(蘇氨酸)取代Ser65(絲氨酸)(Cormack et al.,1996)。基于等量溶解蛋白的光譜分析，由于Em(消光系數(shù))的增加和色基構(gòu)型的率，EGFP在488nm處激發(fā)后燈熒光強(qiáng)度為wtGFP的35倍(Cormack et al.,1996;Yang et al.,1996)。在相同條件下(489nm)測(cè)得EGFP得Em為53，000cm-1M-1，而wtGFP為9，500CM-1M-1，GFPS65T為55，000cm-1M-1(Patterson et al.,1997)。EGFP的色基構(gòu)型在37℃比wtGFP或GFPS65T發(fā)光效率更高，在這一溫度下表達(dá)的EGFP可溶性蛋白95%為有效色基(Patterson et al.,1997)。GFPS65T為Thr取代Ser65的突變體(Heim et al.,1995)，同樣條件下，它的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于wtGFP4～6倍，并且其的Redshifted激發(fā)峰位于490nm，但37℃時(shí)色基形成的效率不如EGFP。