GFP轉基因擬南芥的培養及熒光觀察

實驗原理：
1.GFP報告基因
 全稱為綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein， GFP），簡稱GFP，20世紀60年代在水母中發現的發光蛋白。由238氨基酸組成的單鏈多肽，在藍光或紫外光激發下發出綠色熒光，用于蛋白質在活細胞中的準確定位及動態變化觀察（分泌蛋白的分選、亞細胞定位）
2.目的基因
MAP65-1，是一種微管結合蛋白，可以根據擬南芥葉片表皮細胞、保衛細胞，下胚軸和根部細胞中微管骨架的分布情況來推斷目的基因是否存在。
3.表達載體：
植物表達載體的構建→導入農桿菌自我復制→浸染花粉轉入擬南芥； 卡那霉素抗性培養基篩選，
卡那霉素:
抗生素
影響植物細胞葉綠體和線粒體的蛋白合成,引起植株黃化死亡.卡那霉素能對轉基因植物進行篩選實質上是通過卡那霉素抗性基因起作用的。轉基因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通過卡那霉素,轉化體就很容易從非轉化體中篩選出來。

GFP轉基因植株 野生型植株 GFP轉基因植株 轉基因植株
1/2MS培養基 1/2MS卡那抗性培養基

實驗材料：
GFP轉基因擬南芥種子及野生型種子；1/2MS培養基 ；1/2MS卡那抗性培養基； 75％乙醇；10％NaClO；無菌水。

GFP轉基因擬南芥實驗步驟：

1.種子春化（ 加蒸餾水放入4℃冰箱中過夜）；
2.751min（混勻，盡量將液體吸凈，動作要快）；
3.10％消毒10min （混勻，盡量將液體吸凈，動作要快）；
4. 無菌水洗三遍，用牙簽將種子點在培養基表面（每皿4-5顆種子 盡量均勻）；
5.封膜，做好標記，平放于培養架上培養。

實驗結果：
少等長勢不優良的現象，是因為野生型不存在卡那抗性基因，而轉基因植株存在卡那抗性基因，所以可以將轉基因植株在卡那抗性培養基中篩選出來；在轉基因擬南芥中，熒光標記在不同位置亮度效果不同，我們認為可能是與不同位置微管分布情況和微管結合蛋白對不同位置的結合效果不同有關。

GFP轉基因擬南芥注意事項：

嚴格無菌操作.
消毒過程動作要快.
槍頭不要重復使用，物品不要拿出超凈臺.
點種時每個位置盡量只點一顆子.
操作時盡量避免說話和人員走動.
注意小組內的配合和小組間的協調.

思考題：
1 .本實驗用的了兩種培養基，有何不同？主要作用是什么？
 實驗中分別用到了1/2MS培養基和1/2MS卡那抗性培養基。MS培養基是一種常用的植物組織培養基；在1/2MS培養基中無機鹽為MS培養基的一半。但在1/2MS卡那抗性培養基中添加了一種抗生素—卡那霉素。卡那霉素能對轉基因植物進行篩選實質上是通過卡那霉素抗性基因起作用的。轉基因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通過卡那霉素,轉化體就很容易從非轉化體中篩選出來。
2.什么是GFP? 在生物學研究中有何用途？
GFP是綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein， GFP），簡稱GFP，20世紀60年代在水母中發現的發光蛋白。由238氨基酸組成的單鏈多肽，在藍光或紫外光激發下發出綠色熒光，可以起到標記目的基因的作用。
3.GFP主要使用什么顏色的激發光？你觀察到得熒光是什么顏色？
GFP在藍光或紫外光激發下發出綠色熒光