質粒
質粒是染色體外的小環狀脫氧核糖核酸（DNA），其獨立于染色體DNA復制。盡管發芽酵母和裂變酵母可以保留質粒，但質粒的宿主幾乎是細菌。這種小的環狀DNA被廣泛用作分子生物學，生物化學，生物技術，細胞生物學等領域的DNA載體。這意味著質粒純化/分離是這些研究領域中非常基礎的實驗，并且該實驗幾乎每天都在幾乎每個實驗室中進行。質粒是能夠自主復制的小型環狀DNA分子，多存在于細菌及酵母菌等生物中，是基因工程中最常用的運載體，擔負著將目的基因轉移到宿主細胞中的重要使命。基因表達載體的構建（也就是目的基因與運載體結合）是基因工程的核心步驟，用作運載體的質粒更是掌上明珠。我們需要從細菌中分離出質粒以備后用。

搖菌培養
即培養細菌使質粒擴增
1.將鑒定測序正確的克隆菌液涂在LB固體平板（一種培養基，使質粒擴增）。
2.置于37℃恒溫培養箱，培養12-17h，待長出菌落。
3.滅菌15ml離心管內加入5ml含抗生素的LB液體培養基，編號標記。
4. 挑取單克隆菌團放置液體培養基，每個培養基放置1個菌落。
5. 37℃，180rpm，振蕩培養過夜。

收獲細菌并裂解
1.離心擴增好的菌液，按說明書將菌液重懸，轉入1.5ml離心管中。
2.用質粒小量抽提試劑盒，按說明書要求提取質粒。
3.細菌高速離心1min,徹底去除上清。
4.加入250ulRB溶液，振蕩器充分懸浮細菌。
5.加入250ulLB溶液。立即上下顛倒10次，使細菌裂解，室溫，放置2min。
6.加入250ulNB溶液。立即上下顛倒10次，使之充分中和，室溫，放置2min。
7.室溫，1500rpm，高速離心15min。
8、將吸附柱放入收集管內，離心得到的上清轉移至吸附柱，室溫，15000rpm，高速離心30s。
9、棄廢液，將吸附柱放入收集管，加入700ul WB溶液到吸附柱中，15000rpm，高速離心30s。
10、重復上一操作。
11、將吸附柱放入干凈的1.5ml 離心管中，加30-50ul預熱的Elution Buffer，室溫，放置2min，高速離心1min。
12、樣品進行電泳檢測：1%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為2ul，紫外燈下觀察，最明亮的帶為超螺旋形式，可以在一定程度上表明提取質粒的純度。

質粒的純化
1. 將之前提取好的質粒放入1.5ml離心管中，加入1/10體積的3mol/L 無菌乙酸鈉溶液。
2. 加入2倍體積的無水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6h或過夜。
3. 4℃，高速離心機14000rpm，離心20min.
4. 棄去上清，70%乙醇洗2次。
5. 空氣干燥，可置超凈工作臺干燥。
6. 加200ul無菌水溶液干燥后所得沉淀，即為質粒溶液。
7. 紫外分光光度計測量質粒濃度和產量。

質粒純化故障排除
質粒DNA純化（眾所周知的質粒制備）是實驗室中最常用的方法之一。準備包括；細菌培養物的生長，細菌細胞的收獲和裂解以及質粒DNA的純化。純化的質粒DNA進一步用于下游過程，例如：克隆，基因轉移，轉化或測序。可以改進幾個步驟以獲得更高的產量或消除最終產品中的污染。
如果您遇到問題，請不要擔心！故障排除指南可為您提供幫助。

細胞裂解不完全
細胞密度過高：減少培養體積。
細胞沉淀未完全重懸：在細胞裂解前，使用適當的緩沖液或溶液適當重懸細胞沉淀。
堿裂解步驟不足：檢查裂解溶液中是否有鹽沉淀。

DNA或RNA污染
基因組DNA污染：在裂解和中和步驟中，請勿過度劇烈渦旋細胞。
凍干的RNase不能完全溶解：按照方案中的說明溶解RNase。
RNA污染：使用前，將RNase加入重懸溶液中。
細菌細胞過多：減少培養量，以免反應或色譜柱超負荷。
文化太老了：不要使用培養時間超過24小時或已經處于死亡階段的文化。

產量低或沒有
培養體積太高：減少培養體積以增加裂解細胞的數量。
質粒不繁殖：使用新鮮條紋細菌細胞進行接種。
選擇性壓力太低：在培養過程中使用適量的抗生素，以避免沒有目的質粒的未轉化細胞過度生長。
未立即處理培養物：始終使用新鮮種植的培養物。如果您需要另的準備工作，沉淀細胞，除去培養基，然后將細胞沉淀保存在-70°C。
套件組件的有效性降低：將套件組件存儲在適當的條件下。
洗滌液濃度過高：蓋緊瓶蓋，避免乙醇蒸發。

下游流程性能不佳
其他質粒形式包括：避免質粒DNA變性-不要延長細胞裂解時間，不要超過實驗方案的建議。
質粒DNA濃度太低：沉淀質粒DNA并以較小體積重懸以濃縮DNA。
重懸的質粒DNA中存在乙醇：增加干燥時間。

質粒純化技巧
在質粒制備過程中，請確保使用諸如乙酸鈉之類的鹽以幫助核酸從溶液中沉淀出來。
帶正電荷的鈉離子與質粒的糖-磷酸主鏈反應，使質粒更疏水，在水中的溶解度更低。
乙酸鈉在DNA質粒純化中特別有效
使用氯化鋰作為鹽純化RNA質粒
在質粒制備過程中，如果樣品很小，體積足夠或需要更長的存儲時間，請確保使用乙醇作為溶劑。

核酸和鹽都比乙醇難溶于異丙醇。
如果您只能將1體積的酒精放入1體積的DNA樣品中，請改用異丙醇
在質粒制備過程中，確保將DNA，乙酸鈉和乙醇混合物在至少-4°C的溫度下孵育大約20分鐘。但是，優選-20℃或-40℃。
如果產量低，請嘗試將孵育時間延長至30-60分鐘
其他技巧
質粒制備中不要使用過多的生物量。