熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(ere-vtg：egfp)質(zhì)粒的構(gòu)建及驗證
隨著全球工業(yè)化的推進，人們對環(huán)境雌激素(environmental estrogens，EEs)的生物影響越來越關(guān)注。EEs指能干擾人和生物內(nèi)分泌活動的具有雌激素樣效應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)[1]，主要包括：天然雌激素，如雌激素酮(estrone)、雌二醇(17β-estradiol，E2)、雌三醇(estriol，E3)；人工合成雌激素，如17α-炔雌醇(17α-ethynylestradiol，EE2)；環(huán)境化學(xué)污染物，如雙酚A(bisphenol A，BPA)、殺蟲劑、增塑劑等[2]。EE2是一種常見的EEs [3]，廣泛存在于口服避孕藥中，其半衰期長且經(jīng)生物鏈富集后，在魚體內(nèi)的濃度可高于自然水體的數(shù)百倍[4]。
EEs主要通過污水排放和地表水徑流進入水體環(huán)境，其在全世界范圍內(nèi)的污染狀況不容樂觀[5]。Wang等[6]檢測了三峽水庫區(qū)域的地表水和沉積物中的8種EEs，其中辛基酚、E3和EE2更高檢出質(zhì)量濃度(后簡稱“濃度”)分別達120、81.6、35.3ng/L。Pelayo等[7]在西班牙河流的天然水體中檢出的E2濃度高達130ng/L。Kuster等[8]在巴西里約熱內(nèi)盧地表水中檢出366 ng/L的植物性雌激素及47 ng/L的孕激素。上述EEs的低水平、長期、慢性接觸，將是新世紀EEs對人體內(nèi)分泌和生殖健康影響的基本方式。因此，尋找能適應(yīng)多重機制、直觀簡便、敏感特異地監(jiān)測環(huán)境中EEs污染程度的檢測方法是環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。
斑馬魚(zebrafish，Danio rerio)作為模式生物已在環(huán)境毒理學(xué)評價中得到廣泛的應(yīng)用[9]。研究表明，在EE2誘導(dǎo)下，斑馬魚表達卵黃蛋白原(vitellogenin，vtg)的水平與EE2的濃度呈正相關(guān)[10-11]。根據(jù)EE2誘導(dǎo)vtg表達這一特點[12]，本科題組構(gòu)建了由vtg啟動子啟動報告基因綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的Tg(ere-vtg:egfp)質(zhì)粒[13]。EE2誘導(dǎo)顯微注射Tg(ere-vtg:egfp)質(zhì)粒的斑馬魚表達綠色熒光蛋白，與誘導(dǎo)野生型斑馬魚表達vtg具有很好的一致性，EE2暴露后轉(zhuǎn)基因斑馬魚綠色熒光蛋白的表達即可表示vtg的相應(yīng)表達[14]，這種穩(wěn)定傳代的Tg(ere-vtg:egfp)轉(zhuǎn)基因斑馬魚，在一定濃度范圍(0.1~100 ng/L)內(nèi)，可以直觀方便地動態(tài)監(jiān)測EEs污染情況。

1   材料與方法
1.1   斑馬魚品系及養(yǎng)殖
野生型(AB系)斑馬魚購自斑馬魚國際資源中心(Oregon，美國)，自然產(chǎn)卵后收集胚胎。野生型和Tg(ere-vtg:egfp)轉(zhuǎn)基因斑馬魚的飼養(yǎng)按The Zebrafish Book操作[15]。在部分實驗中，為了防止受精后24小時(24 hour post fertilization，24 hpf)的胚胎及后續(xù)幼魚的色素形成，系統(tǒng)水中會加入終濃度為2×10-4 mol/L的1-苯基-2-硫脲(1-phenyl-2-thio-urea，PTU)。
1.2   Tg(ere-vtg:egfp)質(zhì)粒的構(gòu)建及顯微注射
以AB系斑馬魚基因組DNA為模板經(jīng)PCR獲取vtg基因編碼區(qū)上游1.7 kb可能包含啟動子的5’非翻譯區(qū)序列，將39 bp的雌激素反應(yīng)元件(estrogen response element，ere)經(jīng)酶切連接到vtg啟動子的5’端，將這段融合基因經(jīng)酶切連接克隆到含有增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)報告基因的表達載體pEGFP-1中。在解剖顯微鏡觀察下，將線性化的Tg(ere-vtg:egfp)質(zhì)粒顯微注射到1~2個細胞期的斑馬魚胚胎中。注射后的胚胎收集培養(yǎng)在含有10 ng/L EE2的孵化液中，每日更換培養(yǎng)液、挑出死亡胚胎并在熒光顯微鏡下觀察。

1.3   轉(zhuǎn)基因斑馬魚系的建立
經(jīng)10ng/L EE2暴露1周后，篩選綠色熒光陽性的嵌合體，在系統(tǒng)水中飼養(yǎng)至性成熟后，與野生型斑馬魚雜交，其后代繼續(xù)以10ng/L EE2暴露一周，挑選有綠色熒光出現(xiàn)的F1代，喂養(yǎng)至性成熟后，與野生型斑馬魚雜交，繼續(xù)進行繁殖遺傳篩選，直至得到與野生型斑馬魚交配產(chǎn)生的Fn代出現(xiàn)有熒光，提示Fn-1代斑馬魚被確定為純合子。由此建立Tg(ere-vtg:egfp)轉(zhuǎn)基因斑馬魚系，并繼續(xù)組內(nèi)交配傳代。

1.4   暴露實驗
1.4.1   敏感性鑒定實驗
將轉(zhuǎn)基因斑馬魚純合子幼魚置于盛有1 L EE2溶液的魚缸中暴露1周。暴露組濃度分別為100、10、1 ng/L(EE2)，溶劑對照為5 μL/L乙醇。隨機放入100個胚胎/缸。為了避免EE2被幼魚吸收或水分蒸發(fā)導(dǎo)致的暴露濃度改變，每天更換EE2溶液和乙醇溶液。分別在暴露后60、72、84、96、108、120、144 h時，計數(shù)表達綠色熒光蛋白的幼魚數(shù)量并計算百分比，重復(fù)3次實驗。純合子轉(zhuǎn)基因斑馬魚的胚胎暴露實驗方法與上述方法相同，根據(jù)各暴露組出現(xiàn)綠色熒光的時間，進行持續(xù)觀察，并在出現(xiàn)綠色熒光時拍照記錄。

1.4.2   特異性鑒定實驗
雌激素衍生物或活性類似物有很多種，包括E2、己烯雌酚(diethylstilbesterol，DES)、E3、氯化鎘(cadmium chloride，CdCl2)、玉米烯酮、BPA。另外，除上述EEs外，課題組還購買了雌激素結(jié)構(gòu)類似物(同為甾體類固醇激素的孕酮和皮質(zhì)激素17-羥固醇)。每種物質(zhì)均配制1×108、1×107、1× 106、1×105、1×104、1×103、1×102、10、1 ng/L濃度的溶液，每種物質(zhì)低濃度向高濃度依次進行轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚暴露試驗，連續(xù)7 d，每天更換暴露溶液后觀察綠色熒光，直到觀察到綠色熒光蛋白表達為止，更高濃度不做檢測。

1.5   顯微鏡觀察和成像
使用配備GFP過濾器且具有DP70數(shù)碼相機的SZX12顯微鏡(Olympus，日本)觀察斑馬魚的胚胎、幼魚和成魚并拍照。

1.6   逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測vtg表達
根據(jù)Trizol試劑盒(Invitrogen，美國)的說明書分別提取樣品成魚肝臟或幼魚全魚的總RNA。用oligodT引物和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega，美國)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以此cDNA為模板，用引物(vtg1F：5’-GTTCAACCTTGTTCCCGAG-3’和vtg1R：5’-GATCC ATAAGCTTCATCAGG-3’)進行PCR，檢測vtg1基因的表達水平。以ELF1α的特異性引物(F：5’-CTTCGTC CCAATTTCAGGAT-3’；R：5’-CAGAGACTCGTGGTGC ATCT-3’)作逆轉(zhuǎn)錄PCR的上樣量對照。PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳。

1.7   統(tǒng)計學(xué)分析
采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。各組GFP表達量比較采用方差分析法分析，vtg蛋白含量比較及其基因條帶光密度比值的比較采用Kruskal-Wallis H法。檢驗水準α=0.05。

2   結(jié)果
2.1   轉(zhuǎn)基因斑馬魚系的建立
對8 000個胚胎顯微注射Tg(ere-vtg:egfp)質(zhì)粒后，經(jīng)EE2暴露，有GFP表達的性成熟的嵌合體轉(zhuǎn)基因斑馬魚共119條。其中，僅有1條可將egfp基因遺傳給下一代，即生殖系嵌合體轉(zhuǎn)基因斑馬魚，嵌合子F0代，其與野生型斑馬魚雜交得F1代；經(jīng)EE2暴露，GFP表達比例低于1%。飼養(yǎng)至性成熟的F1代與野生型斑馬魚雜交得50%雜合子的F2代；經(jīng)EE2暴露并進行熒光篩選后，共183條(雌性101條，雄性82條)可雜交并生育后代(F3代)。F3代經(jīng)EE2暴露并進行熒光篩選后，挑選產(chǎn)卵較好的斑馬魚(雌性78條，雄性88條)為純合子篩選對象(圖 1)；最終，共挑選出10對純合子作為種魚，交配產(chǎn)卵供后續(xù)的敏感性鑒定和特異性鑒定。10 ng/L EE2暴露時野生型和Tg(ere-vtg:egfp)轉(zhuǎn)基因斑馬魚的GFP表達見圖 2。另外，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EE2暴露后表達GFP的幼魚，換入系統(tǒng)水飼養(yǎng)2周左右后，GFP表達量明顯減少，部分斑馬魚幼魚GFP表達消失，說明EE2誘導(dǎo)Tg(ere-vtg:egfp)轉(zhuǎn)基因魚GFP表達具可逆性。

2.2   敏感性鑒定
EE2誘導(dǎo)Tg(ere-vtg:gfp)轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚表達GFP與濃度、時間有關(guān)。時間相同時，GFP在幼魚中的表達率可隨暴露濃度增加而增加(P＜0.05)；濃度相同時，暴露時間越長，GFP的表達率越高(P＜0.05)。由圖 3可見，當(dāng)EE2暴露濃度為1 ng/L時，96 hpf前無幼魚出現(xiàn)GFP表達，暴露時間分別為108、120、144 h時，表達GFP的幼魚分別占總數(shù)的2.6%、4%、6.3%。當(dāng)EE2暴露濃度為10 ng/L時，表達GFP幼魚的比例隨時間增加(60~120 h及144 h)而增加，分別為2.0%、4.7%、7.3%、11.3%、14.0%、17.6%、24.7%。當(dāng)EE2暴露濃度為100 ng/L時，表達GFP幼魚的比例隨時間增加而增加，分別為17.3%、42.6%、58.7%、70.3%、73.8%、76.6%、77.3%。結(jié)果顯示，本課題組構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因斑馬魚在EE2 100 ng/L水平有急性響應(yīng)。在較低濃度時也具有反應(yīng)性，但需較長時間。

2.3   特異性鑒定
選擇包括E2、E3、DES、玉米烯酮、酚類代表性化學(xué)物BPA、金屬類代表物CdCl2在內(nèi)的雌激素衍生物或活性類似物，以及雌激素結(jié)構(gòu)類似物即同為甾體類固醇激素的孕酮和皮質(zhì)激素17-羥固醇作為受試物，用Tg(ere-vtg:egfp)轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚進行暴露試驗，觀察是否能誘導(dǎo)出現(xiàn)熒光。

由圖 5可知，各組的10條斑馬魚均出現(xiàn)肉眼可見熒光的濃度分別為：在100 ng/L濃度組E2和DES，1 000 ng/L的E3暴露組，1×104 ng/L的CdCl2暴露組，1×105 ng/L的玉米烯酮暴露組，1×106 ng/L的BPA暴露組。然而，結(jié)構(gòu)類似物孕酮和17-羥固醇在各濃度均沒有GFP表達，故未放入圖中進行比較。上述結(jié)果提示，Tg(ere-vtg:egfp)轉(zhuǎn)基因斑馬魚有可能是水體EEs污染的活的監(jiān)測器。

3   討論
轉(zhuǎn)基因斑馬魚是指在魚體內(nèi)轉(zhuǎn)入一些DNA片段，這些片段是特定化學(xué)物的效應(yīng)元件，能使魚對特定毒物更加敏感，提高靈敏度。Carvan Ⅲ等[16]利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚的某些效應(yīng)元件可顯示接觸的特定毒物。轉(zhuǎn)基因斑馬魚的DNA片段含芳香烴、親電子物質(zhì)、金屬以及雌激素的效應(yīng)元件，每個效應(yīng)元件結(jié)合一個報告信號如熒光素酶基因或綠色熒光蛋白。在斑馬魚的細胞系中帶有報告基因的效應(yīng)元件也已研制成功[17]。Lee等[18]構(gòu)建了一種新穎敏感的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型，當(dāng)暴露于環(huán)境雌激素，可以誘導(dǎo)包括肝臟、心臟、骨骼肌、前腦神經(jīng)等靶組織的GFP表達，以此實時評估對生物體的綜合健康影響。

斑馬魚的vtg已經(jīng)成為檢測環(huán)境雌激素的核心標志[19-20]。正常情況下，vtg在幼魚或雄魚體內(nèi)含量較低，難以檢測得到，但在環(huán)境雌激素誘導(dǎo)下，雄魚和幼魚可出現(xiàn)vtg表達[21]，而且vtg1的mRNA水平比其他亞型高得多，且其表達水平和EEs的濃度呈正相關(guān)性[11, 22]。Muncke等[23]建立了用斑馬魚胚胎檢測vtg表達水平的MolDar T檢測方法，綜合了體內(nèi)外檢測方法的優(yōu)點，并使檢測更為簡便準確。但是，這種方法需要將魚處死，不適合水環(huán)境中動態(tài)觀察。本研究利用vtg的特點，經(jīng)過遺傳篩選，構(gòu)建了一種Tg(ere-vtg:egfp)轉(zhuǎn)基因斑馬魚系模型。在其體內(nèi)，由vtg基因的啟動子來調(diào)控報告基因GFP的表達。為了增強斑馬魚監(jiān)測EEs的敏感性，我們在啟動子前插入雌激素反應(yīng)原件ere順式作用元件，這種轉(zhuǎn)基因斑馬魚只對EEs活性的物質(zhì)發(fā)生響應(yīng)并能更靈敏地表達GFP。

本研究對典型的雌激素類化合物EE2進行了敏感性研究。當(dāng)EE2濃度大于1 ng/L時，可見轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚呈現(xiàn)明顯的GFP表達。當(dāng)EE2濃度大于0.1 ng/L時，可見轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎呈現(xiàn)明顯的GFP表達。此結(jié)果與Islinger等[24]在成年雄性斑馬魚試驗顯示的vtg和ER-α基因在3、10、30ng/L EE2組中有明顯表達的結(jié)果相一致。Bogers等[25]將具有雌激素反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚暴露于不同濃度的EE2，觀察熒光出現(xiàn)的時間，結(jié)果顯示3 ng/L和10 ng/L EE2可在30 hpf誘導(dǎo)GFP表達。與之相比，本研究中Tg(ere-vtg:egfp)轉(zhuǎn)基因斑馬魚的敏感性較高。特異性研究結(jié)果表明，Tg(ere-vtg:egfp)轉(zhuǎn)基因斑馬魚能直觀地檢測水中的雌激素，對于上文提及的甾體類固醇激素如孕酮和皮質(zhì)激素17-羥固醇，雖與雌激素結(jié)構(gòu)類似但不能誘導(dǎo)vtg表達，其濃度高達100 mg/L時也不能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因斑馬魚表達GFP。

綜上所述，轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(ere-vtg:egfp)對EEs的識別是依據(jù)雌激素樣活性，說明其對EEs的識別與檢測具有很好的敏感性、特異性和普適性。更重要的是，這種Tg(ere-vtg:egfp)轉(zhuǎn)基因斑馬魚用于水環(huán)境監(jiān)測可以實時動態(tài)地發(fā)現(xiàn)雌激素污染程度的變化。若用相同的思路和技術(shù)，可以應(yīng)用于構(gòu)建其他轉(zhuǎn)基因斑馬魚來監(jiān)測各種環(huán)境污染物，比如將vtg1啟動子替換成其他污染物敏感的啟動子。已有報導(dǎo)，Xu等[26]構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因斑馬魚(cypla:gfp)在體檢測水體中二噁英類污染物，主要誘導(dǎo)肝、腎和腸道的GFP表達；Matz等[27]利用hsp70啟動子構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因斑馬魚來檢測金屬離子鎘。同時，該轉(zhuǎn)基因技術(shù)也可用于環(huán)境雌激素作用機制的研究。

根據(jù)本研究結(jié)果，作者認為，這種熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚是名副其實的“生態(tài)燈泡”，充當(dāng)成千上萬個受污染物威脅的飲水源的活的監(jiān)測器。這種轉(zhuǎn)基因斑馬魚與理化分析手段相比，其檢測EEs速度較快(只需2 min，而大多數(shù)傳統(tǒng)的檢測方法需2 d)，而且檢測可在活體胚胎內(nèi)直接進行。此外，還能觀察到連續(xù)暴露于EEs的整個生命過程。這將有助于把斑馬魚同一個體早期胚胎細胞直接與其后的生理、行為的其他觀察終點聯(lián)系起來，具有直觀、客觀、綜合和歷史可追溯性等特點，可反映環(huán)境污染的客觀狀況。總之，隨著各種環(huán)境污染物轉(zhuǎn)基因斑馬魚研究和應(yīng)用的深入，它們將在EEs環(huán)境監(jiān)測和危險度評價領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。