乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一類能夠利用碳水化合物發酵產生大量乳酸，降低發酵產品的pH值，不形成芽孢的革蘭氏陽性、兼性厭氧細菌的總稱[1-2]。大多數乳酸菌無毒、無害，對人體及動物體具有益生作用，因此被稱為益生菌[3-5]。隨著近20幾年來分子生物學的發展，以乳酸菌作為表達載體的基因表達系統的構建和應用成為目前的研究熱點之一，一些外源基因也被報道在乳酸菌中表達成功[6]。例如，Renye等[7]利用在乳酸菌表達中常用的Nisin (乳酸鏈球菌素)誘導表達系統NICE生產片球菌素；Abdullah等[8]用乳酸菌表達菌株中常用的乳酸乳球菌NZ9000表達了大腸桿菌的熱休克蛋白DnaK。

熒光蛋白具有穩定性強、無物種專一性、易于在細胞內表達等特點[9-10]，因此，已作為標記物而廣泛應用于生命科學領域[11-15]。目前，國內已有熒光蛋白成功標記乳酸菌的報道，但相關研究成果并不多。2009年，陳曉雷等[16]構建了綠色熒光蛋白GFP標記穿梭表達載體pW425et-GFP，實現了綠色熒光蛋白GFP在嗜酸乳桿菌1.1878中的表達。2014年，徐一軻[17]成功構建了表達增強型綠色熒光蛋白eGFP的重組乳酸乳球菌BLCC02-0018。2017年寇田田等[18]構建了以紅色熒光蛋白基因(dsred2)為標記，以α-淀粉酶(amy)為報告基因的表達載體，成功實現了融合基因dsred2-amy在干酪乳桿菌中的融合表達。前人報道表明不同熒光蛋白對不同宿主乳酸菌的標記能力有強弱，因此，更多的熒光蛋白標記需要被開發及應用于更多乳酸菌宿主菌株。

近年來，紅色熒光蛋白mcherry用于熒光標記的研究報道逐漸增多，相對其他熒光蛋白，該熒光標記具有標記基因小、背景低等優點，且與已報道的dsred2紅色熒光基因相比，其熒光強度及穩定性更好[19-25]。2015年van Zyl等[26]報道了利用mCherry熒光蛋白標記蒙氏腸球菌ST4SA和植物乳桿菌423的研究，這是mCherry熒光蛋白標記乳酸菌的報道，而國內關于mCherry熒光蛋白標記乳酸菌的研究尚未見報道。本文開展了mCherry熒光蛋白對植物乳桿菌的標記研究，選用的植物乳桿菌WCFS1菌株是全基因組序列率先公布的乳酸桿菌，不僅自身具有益生和腸道中高存活率特性[27]，同時已有多個外源蛋白在該菌株中表達成功的報道[28-30]，是公認的乳酸菌分子生物學研究中的模式菌株。膽鹽水解酶BSH是本實驗室研究多年的乳酸菌功能性酶，近期研究報道該酶可能和乳酸菌腸道定植相關[31-32]。因此，本文通過建立以mCherry熒光蛋白為標記、膽鹽水解酶基因bsh為報告基因的融合蛋白表達系統，為更多外源活性蛋白在乳酸菌中進行功能性研究奠定基礎，也為研究乳酸菌在生物體內的定位、示蹤及益生性作用機制提供有效的技術手段。

1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和質粒
1.1.2 培養基及培養條件
大腸桿菌DH5α用LB培養基37 ℃振蕩培養。植物乳桿菌用MRS培養基37 ℃靜置培養。在大腸桿菌中，氨芐青霉素、卡那霉素和紅霉素使用濃度分別為100 μg/mL、30 μg/mL和250 μg/mL。在乳酸菌中，紅霉素使用濃度為10 μg/mL，誘導劑SppIP使用濃度為25 ng/mL。
1.1.3 引物
mCherry和egfp基因序列的特殊性設計共用引物如下：P1和P2，此對引物引入了NdeⅠ和XbaⅠ兩個酶切位點。根據質粒pSIPH462上bsh基因序列，設計引物：bsh1和bsh2，在目標片段兩端皆引入XbaⅠ酶切位點。根據GenBank (登錄號為AL935263.2)的WCFS1上ldhL基因的啟動子序列、質粒pMG36e上P32啟動子序列和GenBank (登錄號為CP000416.1)的短乳桿菌ATCC 367上slpA基因的啟動子序列，分別設計引物對如下：PldhL1-PldhL2、P32F-P32R以及PslpA1-PslpA2，上游引物皆引入BglⅡ酶切位點，下游引物皆引入NcoⅠ和NdeⅠ兩個酶切位點。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本實驗所需引物序列見表 2。
1.1.4 主要試劑及儀器
限制性內切酶NdeⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ、BglⅡ、HindⅢ、rTaq、Ex Taq、DNA marker、PrimerStar Max和DNA切膠回收試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；氨芐青霉素、卡那霉素、紅霉素、溶菌酶、SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、Bradford法蛋白濃度測定試劑盒、茚三酮等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；SppIP誘導肽(序列：MAGNSSNFIHKIKQIFTHR)也由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；T4 DNA連接酶購自NEB(New England Biolabs)公司；His標簽抗體等購自美國Cell Signaling公司。牛磺膽酸鈉(Sodium Taurocholate，TCA)購自美國Sigma公司。
Personal PCR儀，AG 4309型高壓脈沖電擊轉化儀，1 mm電擊杯，CL-22M型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；Gel Doc XR+型凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司；HE-90型電泳儀，水平電泳槽，上海天能科技有限公司；高強度紫外線燈，美國路陽儀器設備有限公司；生物樣品勻質器，杭州奧盛儀器有限公司；IX73型倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司；Infinite 200 PRO酶標儀，瑞士TECAN公司。

1.2 方法
1.2.1 熒光蛋白eGFP和mCherry表達載體的構建及鑒定
以載體pTracer-CMV3和pmCherry-C1質粒DNA為模板，利用引物P1和P2分別擴增egfp和mCherry基因，分別用NdeⅠ和XbaⅠ雙酶切，與經相同酶切處理的pSIPH460載體片段連接，連接液轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，在含紅霉素的LB平板上篩選。構建獲得的處于啟動子PsppA調控下的egfp基因和mCherry基因的誘導型重組載體分別命名為pSIPH471和pSIPH472。電轉化植物乳桿菌WCFS1感受態細胞后，獲得的重組菌命名為YeG471和YmC472，含空載質粒pSIPH460的對照菌株命名為YE460。

1.2.2 熒光蛋白mCherry-BSH融合表達載體的構建及鑒定
以本實驗室保藏的含羅伊氏乳桿菌膽鹽水解酶bsh基因的pSIPH462質粒為模板，利用引物對bsh1和bsh2通過PCR擴增bsh基因，用XbaⅠ單酶處理回收片段，與經相同酶處理的pSIPH472載體進行連接，含紅霉素的LB平板上篩選，獲得的陽性克隆命名為pSIPH473。將pSIPH460、pSIPH462、pSIPH472和pSIPH473先后電轉化植物乳桿菌NB5462的感受態細胞中，獲得的重組菌株相應命名為YbE460、YbB462、YbmC472和YbBmC473。

1.2.3 組成型熒光蛋白mCherry-BSH融合表達載體的構建及鑒定
以植物乳桿菌WCFS1全基因組、質粒pMG36e及短乳桿菌ATCC 367全基因組為模板，利用PldhL1-PldhL2、P32F-P32R和PslpA1-PslpA2引物對，分別擴增PldhL、P32和PslpA 3種啟動子DNA片段，然后進行TA克隆。測序正確的3種陽性克隆質粒經NdeⅠ和BglⅡ雙酶切后，分別與經相同酶處理的pSIPH473連接，構建獲得的含啟動子PldhL、P32和PslpA的載體分別命名為pLDHLH673、pP32H771和pSLPAH871。電轉化植物乳桿菌NB5462的感受態細胞后，獲得的重組菌株相應命名為YbBmC673、YbBmC771和YbBmC871。

1.2.4 重組蛋白的表達及Western blotting鑒定
誘導型重組菌株經25 ng/mL SppIP誘導表達過程按照Nguyen等所述方法進行[28, 33]。制備的粗酶液用Bradford法蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，并通過調節蛋白濃度，使取液量中總蛋白量一致，12% SDS-PAGE檢測。轉PVDF膜，TBST洗滌10 min，浸于5%脫脂乳封閉液中，室溫下封閉1 h。封閉結束后，經TBST振蕩洗滌，加入稀釋比例為1:2 500 His標簽抗體孵育液，孵育1 h后洗滌顯色。

1.2.5 重組蛋白表達的熒光活性觀察與檢測
將誘導表達或連續培養的菌液離心收集沉淀，用PBS洗滌2次，取10 μL滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，在倒置熒光顯微鏡下分別觀察綠色和紅色熒光。
為建立生長曲線和熒光強度變化趨勢線，重組菌株于100 mL培養液中生長，每隔2 h取樣，直至培養34 h停止。樣品經PBS洗滌后，利用紫外分光光度計和酶標儀分別檢測樣品OD600值和熒光強度值，eGFP熒光蛋白于激發波長EX：488 nm和發射波長EM：511 nm下檢測熒光強度，mCherry熒光蛋白于激發波長EX：587 nm和發射波長EM：620 nm下檢測熒光強度[24]。

1.2.6 重組蛋白表達的膽鹽水解酶活性測定
重組蛋白表達方法見1.2.4，膽鹽水解酶BSH活性測定方法參考文獻[34]做少許修改。培養后的重組菌株，經離心，用1 mL 0.1 mol/L的PBS(pH 6.0)洗滌2次，沉淀重懸于500 μL PBS中。吸取100 μL菌懸液至1.5 mL的離心管中，反應體系200 μL，底物牛磺膽酸鈉(TCA)終濃度20 mmol/L。水解反應于37 ℃水浴1 h，加入200 μL 15%三氯乙酸終止反應，立即12 000 r/min離心10 min，取100 μL上清液與900 μL茚三酮溶液混合，沸水浴14 min，冰浴5 min后測OD570數值計算酶活。根據牛磺酸-茚三酮標準曲線，得樣本中游離氨基酸濃度，計算BSH酶活。一個酶活單位(U)定義為每分鐘每毫升菌液與底物反應后釋放出的游離氨基酸的量μmol。

2 結果與分析
2.1 eGFP和mCherry熒光蛋白重組表達質粒構建及酶切鑒定
分別以質粒pmCherry-C1和pTracer-CMV3的質粒DNA為模板，PCR擴增egfp和mCherry兩種熒光蛋白編碼基因，目的片段均為約750 bp (圖 1A)，TA克隆后測序結果表明擴增到的egfp和mCherry基因與質粒公布的序列完全一致。依方法1.2.1構建的重組質粒經NdeⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定，獲得預期大小片段，進一步測序顯示重組表達質粒pSIPH471 (含egfp基因)和pSIPH472 (含mCherry基因)構建正確(圖 1B)。
2.2 eGFP和mCherry熒光蛋白的重組表達及熒光活性檢測
依方法1.2.4，在重組菌株誘導表達至3 h，取破碎后上清液做Western blotting檢測，如圖 2，結果顯示重組蛋白表達出與預期eGFP (28.7 kDa)和mCherry (28.3 kDa)蛋白分子大小一致的條帶，條帶大小約為28 kDa。空載對照菌株則沒有表達條帶。
將誘導表達3 h的重組乳酸菌YeG471和YmC472的菌懸液置于倒置熒光顯微鏡下觀察。結果表明，在對應的熒光激發光條件下，重組eGFP菌株YeG471檢測到綠色熒光，但是由于視野內背景綠色熒光也很強，因此菌株的熒光標記不明顯(圖 3A)。不同的是，重組mCherry菌株YmC472檢測到紅色熒光，但是由于視野內背景沒有熒光，因此菌株的熒光標記清晰而顯著(圖 3B)。該結果說明相比eGFP熒光標記而言，mCherry紅色熒光蛋白更適用于標記植物乳桿菌WCFS1，因此，本研究隨后確定了mCherry蛋白作為植物乳桿菌WCFS1的熒光標記進行深入研究。

2.3 誘導型mCherry-BSH融合表達載體的構建、重組表達及活性鑒定
依方法1.2.2，將質粒pSIPH462上來源于羅伊氏乳桿菌的膽鹽水解酶基因bsh克隆至pSIPH472質粒mCherry基因的C端，構建獲得mCherry-BSH融合表達載體，命名為pSIPH473。將質粒pSIPH473電轉化植物乳桿菌NB5462后獲得的重組菌株命名為YbBmC473，構建策略見圖 4。重組的融合蛋白mCherry-BSH編碼基因是在啟動子PsppA調節下表達的，由于該啟動子是誘導型啟動子，因此，融合蛋白mCherry-BSH的重組表達方式是誘導型的，需要向培養基中添加SppIP作為誘導劑從而開啟基因的表達。
依方法1.2.4，在重組菌株經25 ng/mL SppIP誘導表達3 h后，取破碎后上清液進行Western blotting檢測(圖 2)，結果顯示重組蛋白表達出與預期mCherry-BSH融合蛋白(65.3 kDa)分子大小一致的條帶，條帶大小約為64 kDa。該結果說明了重組菌YbBmC473表達了mCherry-BSH融合蛋白。

將重組菌株YbBmC473活化轉接至相應抗性培養基中，在OD600至0.3時加入誘導劑SppIP誘導蛋白表達。樣品經測定后，建立了樣品菌濃度、紅色熒光強度以及膽鹽水解酶BSH酶活性隨時間變化曲線(圖 5)。首先，從重組菌生長情況來看(圖 5A)，2個含mCherry基因的表達菌株YbBmC473和YbmC472與對照菌株之間無明顯差別，表明mCherry熒光蛋白的表達對乳酸菌WCFS1無毒或低毒性，不影響菌株生長。其次，從重組菌熒光產生結果(圖 5B)來看，重組菌YbmC472和YbBmC473均檢測到熒光，2個菌株產生熒光的趨勢相一致，即經SppIP誘導后熒光強度均是在菌體生長對數期中期(10 h)達到更高(37907 RFU和33707 RFU)，隨后逐漸下降，其中，融合了BSH蛋白的重組菌YbBmC473熒光強度略低。該結果說明單獨表達的mCherry熒光蛋白可成功標記植物乳酸菌WCFS1，而融合目的蛋白后仍舊表達較高熒光強度。最后，從重組菌膽鹽水解酶BSH活性表達情況來看(圖 5C)，融合了mCherry基因重組菌株YbBmC473檢測到了BSH酶活性，酶活的產生趨勢與該菌株熒光產生趨勢相一致，在菌株發酵對數期中期(10 h) BSH活性更高，為0.603 U/mL，略低于bsh基因單獨表達菌株YbB462。該結果說明mCherry-BSH蛋白融合表達成功，融合后的蛋白同時具有較高的熒光強度和BSH酶活性。
綜上所述，本研究實現了誘導型mCherry-BSH重組蛋白在植物乳桿菌WCFS1中的融合表達，該結果不僅成功建立了利用mCherry熒光蛋白標記植物乳桿菌WCFS1的有效方法，同時，對目標蛋白熒光標記的成功，也為在以植物乳桿菌WCFS1為例的乳酸菌宿主中異源表達重組蛋白的研究提供了有利條件。

2.4 組成型mCherry-BSH融合表達載體的構建、重組表達及活性鑒定
在構建獲得的質粒pSIPH473基礎上，本研究另外構建了3種不同啟動子調節下的mCherry-BSH融合蛋白表達載體，質粒的構建策略見圖 6。本研究選擇的另外3種啟動子均來源于乳酸菌，且都是被報道在乳酸菌中成功表達外源基因的啟動子。與PsppA不同的是，來源于植物乳桿菌的PldhL、乳酸乳球菌的P32和短乳乳桿菌的PslpA均是組成型啟動子，在此類啟動子調節下，重組蛋白的表達過程中無需添加誘導劑。
以重組菌YbBmC473為對照，首先研究了3種組成型表達重組菌熒光表達情況，見圖 7。與誘導型重組菌YbBmC473熒光產生的趨勢不同，組成型重組菌的熒光強度在菌株生長穩定期(16 h)達到更高，且維持較長時間。在3種不同的啟動子調節下，重組的mCherry-BSH融合蛋白表達的熒光強度也不同。其中，啟動子PldhL調節下重組菌YbBmC673熒光強度更高，培養16 h后熒光值為23 897 RFU，啟動子P32調節下重組菌YbBmC771熒光強度較低，為13 379 RFU，而啟動子PslpA調節下重組菌YbBmC871沒有檢測到熒光。值得注意的是，熒光強度更高的組成型表達重組菌YbBmC673其熒光強度明顯低于誘導型表達重組菌YbBmC473。

隨后，研究了更大熒光強度產生條件下的各個mCherry-BSH融合蛋白表達重組菌的BSH酶活性。結果顯示(圖 7)，各個菌株的膽鹽水解酶BSH活性高低與其融合的mCherry蛋白熒光強弱相對應，即誘導型表達重組菌BSH活性更高，為0.637 U/mL (發酵10 h)，明顯高于組成型表達重組菌，且啟動子PldhL調節下重組菌YbBmC673的BSH酶活性更高，為0.416 RFU (發酵16 h)，啟動子P32調節下重組菌YbBmC771的BSH酶活性次之，而啟動子PslpA調節下重組菌YbBmC871沒有檢測出BSH酶活性。
以上結果表明，在啟動子PldhL調節下，組成型mCherry-BSH重組蛋白在植物乳桿菌WCFS1中也成功實現了融合表達，該表達過程中無需添加誘導劑，簡化了表達過程。

3 討論
本研究利用mCherry紅色熒光蛋白成功標記了植物乳桿菌WCFS1，是繼2015年van Zyl等[26]報道之后mCherry熒光蛋白成功標記乳酸菌的又一例證，填補了國內空白。目前，已有一些文獻報道了eGFP蛋白可標記乳酸菌產生綠色熒光[35-37]，但是本研究結果表明，由于WCFS1菌體自身綠色熒光背景高，eGFP標記植物乳桿菌并不合適。相反，mCherry熒光蛋白標記植物乳桿菌則具有優勢，由于WCFS1菌體自身無紅色熒光背景，隨著mCherry基因的誘導表達，重組菌檢測到明顯的紅色熒光。本研究建立的采用mCherry蛋白標記植物乳酸菌的方法，可廣泛應用于其他乳酸菌的熒光標記工作中，為研究乳酸菌在生物體內的分布、定植及存活情況從而揭示其益生功能的作用機理提供了有利條件。
目前，由于菌體自身安全、不分泌內毒素、表達外源蛋白無需純化可直接同菌體一起進入胃腸道以及自身具有益生功能等優點，乳酸菌已然成為極具潛力的“新興”基因工程菌，具有廣闊的應用前景和研究價值。本研究選取的植物乳桿菌WCFS1菌株便是重要的基因工程模式菌株，已經有細胞因子、功能蛋白以及疫苗藥物分子等在WCFS1中表達成功的報道[27-30, 38-39]。本研究構建了紅色熒光蛋白mCherry基因和乳酸桿菌降膽固醇功能關鍵酶膽鹽水解酶bsh基因的融合表達系統，轉化植物乳桿菌WCFS1后，重組的融合蛋白mCherry-BSH同時檢測到紅色熒光和BSH酶活性，且兩蛋白活性表達互不影響。可以預見，易于觀察、便于檢測的mCherry紅色熒光蛋白將為更多活性蛋白在乳酸菌宿主中的表達、細胞定位、功能鑒定的研究奠定基礎。

此外，本文還研究了3種不同組成型啟動子調節下mCherry紅色熒光融合蛋白表達情況，相較于PslpA調控的基因轉錄在WCFS1中無蛋白活性，在啟動子PldhL調節下，融合蛋白mCherry-BSH具有較高的活性，且表達過程無需添加誘導劑。雖然實驗結果顯示組成型融合蛋白mCherry-BSH的蛋白活性不及誘導型，但是，無需添加誘導劑簡化了操作過程，特別在誘導劑添加困難的目的蛋白表達研究中(如重組菌在實驗動物胃腸道環境中表達蛋白)具有優勢。值得注意的是，本研究構建獲得的mCherry紅色熒光融合蛋白表達系統也可作為植物乳桿菌啟動子探針，為啟動子的篩選提供有效工具。