外源蛋白在煙草葉片瞬時表達 

簡要原理：利用農桿菌將外源基因導入到煙草葉片中進行表達，可以借此進行蛋白的亞細胞定位、蛋白互作(BiFC)和蛋白的純化等實驗操作。

 材料與試劑 

1.一次性注射器

2.培養皿

3.本氏煙草 (Nicotiana benthamiana)

4. 農桿菌菌株：EHA105

5.MES 

6.MgCl2

7. 乙酰丁香酮 (acetosyringone, AS) (上海生工，catalog number: A601111)

8. 抗生素 (根據實驗需求)

9. LB

10.0.5 M MES (pH 5.6) (見溶液配方)

11. MgCl2溶液 (見溶液配方)

12. 100 mM乙酰丁香酮 (見溶液配方)

儀器設備 

1.恒溫搖床 2.分光光度計3.移液槍4.離心機

實驗步驟 

1.挑取轉化有表達質粒的農桿菌克隆(菌株：EHA105)于1 ml含有相應抗生素的LB中，28度搖床250 rpm培養24小時。

2.于5 ml含有相應抗生素的LB中，加入100 μl 0.5 M MES，2 μl 100 mM AS，再接種50 μl農桿菌菌液，28度搖床250 rpm培養至OD600=1.0 (大約12-18小時)。

3. 4,000 rpm常溫離心10分鐘收集菌體，用10 mM MgCl2重懸至OD600=1.0，以每毫升菌液加入2 μl的比例加入100 mM AS，靜置3小時以上。

4.取正處于生長旺盛時期(一個月左右，未開花)的本生煙草(Nicotiana benthamiana)，用注射器吸入菌液，去掉針頭，以手指抵住葉片正面，將菌液從葉片的反面滲透進去(見圖1)，若注射不順暢，可用針頭在葉片上制造一個微小的傷口，再將菌液從傷口注入。

5.正常條件下放置，24-48小時即可取樣。

注意事項 

1.有的文獻報道煙草注射前需黑暗處理，有的文獻則報道需要持續光照處理，個人經驗至少對于蛋白表達這一操作來說不需要任何處理，正常條件生長即可，但是用于蛋白互作(BiFC)可能需要特定的條件，可參見BiFC部分 (參見“煙草體系BiFC”，袁猛等，2018)。

2.表達載體的啟動子一般是35秒，若需要特異基因自身的啟動子驅動，需考慮水稻與煙草的單/雙子葉植物的區別造成的差異。

3.一般情況下，轉化后24小時即有蛋白表達，而48小時后會漸漸消失。

4.若需要提高外源蛋白的表達，可用同樣的方法制備含有番茄叢矮病毒基因p19超表達載體的農桿菌，與目的基因的農桿菌等量混合后再注射煙草，此方法的蛋白表達時間為注射后3-7天，且可以大幅提高表達量，但是只適用于本生煙草 (Nicotiana benthamiana) (Voinnet等, 2003)。

5.如果要抽提并純化蛋白在未用p19的情況下需5-10 g煙草葉片，加p19的情況下可以減半。

溶液配方 

1. 0.5 M MES (pH 5.6)

 MES粉末溶于雙蒸水中，利用1 M KOH溶液調pH值至5.6

2.MgCl2溶液

MgCl2粉末溶于雙蒸水中

3. 100 mM乙酰丁香酮

 乙酰丁香酮粉末溶于雙蒸水中

下面我們來看一下中國熱帶農業科學院使用LUYOR-3415RG觀察煙草葉片的GFP表達的效果圖：

中國熱帶農業科學院

中國熱帶農業科學院簡介：

中國熱帶農業科學院是隸屬于農業部熱帶農業科研機構，創建于1954年，前身是設立于廣州的華南特種林業研究所，1958年遷至海南儋州，1965年升格為華南熱帶作物科學研究院，1994年經批準更為現名。

據2016年11月中國熱帶農業科學院官網顯示，熱科院擁有儋州、海口、湛江和三亞(籌建)院區，科研試驗示范基地6.8萬畝，在海南、廣東設有科研和附屬機構18個;建有省級以上科技平臺70多個和博士后科研工作站3個、以及國際合作平臺12個。截至2016年初，在職職工4035人，專技人員625人，博士411人。

LUYOR-3415：

LUYOR-3415雙波長熒光蛋白激發光源是由美國LUYOR中國公司生命科學事業部大力研發的熒光觀測設備，自儀器研發以來，廣泛的受科研人士喜愛，儀器適用于轉基因植物，動物以及微生物方面的陽性檢測和篩選，可以用于小鼠的伏隔核進行穿孔，結核分枝桿菌重組株的篩選等等.可用于檢測轉GFP,eGFP,DsRed,YFP,CFP,BFP等基因植物，基因動物，基因組織特異性表達，基因微生物等。LUYOR-3415雙波長熒光激發光源采用手持式便攜式設計，方便攜帶，不僅在轉基因的篩選上節省了時間，還有效的解決了傳統的實驗室篩選儀器不能帶到野外進行篩選的問題。儀器采用蓄電池裝置，不用擔心大量購買電池的問題，安全又環保，且電池壽命長達50000個小時，可以進行長時間熒光篩選使用。

科研單位客戶可申請免費試用！

路陽廠家聯系方式：

      華南地區掃此二維碼（聯系方式：18917503797）

      華北地區掃此二維碼（聯系方式：19921813005）