熒光蛋白標記由于其獨特的顏色感官,在醫學、遺傳育種和草地植被抗病中占有重要的位置。熒光蛋白分子標記的選擇與方法與其特異性的 DNA 有關,基因的結構是熒光蛋白標記、進行基因交流和促進基因表達的重要部分。熒光蛋白標記技術主要包括熱激轉導和電擊轉化兩種不同的類型,需通過大腸桿菌作為載體結合菌株,不影響其任何生物功能,是目前大分子示蹤檢測及研究定殖的主要方法,研究熒光蛋白標記對病原菌和根際促生菌的定殖和良好利用優良菌株有著重要意義。但是,熒光蛋白標記是在分子水平,對研究的方法增加了難度。根據目前國內外已有的部分熒光蛋白標記研究,評述了標記的原理,標記的適用性以及標記的不同方法等內容,并展望了不同標記方法對利用熒光蛋白的可能性,以期為研究熒光蛋白標記提供系統的方法參考和技術借鑒。

熒光蛋白標記(fluorescent protein labeling)是指利用不同顏色熒光質粒通過某種方式結合其他生物,最終攜帶有顏色熒光且不影響生物正常生理生長的一種方法[1],因其高靈敏度倍受各位學者的不斷研究,成為目前生
物大分子檢測的主要方法,有著發光強和穩定的優點。熒光標記不需要其他輔助生物發光標記系統,能夠簡化對定殖的研究,促進植物機理的研究,增加物種研究的可視性。不同顏色的熒光標記結合不同的生物是進一步研究的重要條件,有著重要的影響,因此熒光蛋白標記是分子標記的重要手段與方法。熒光蛋白標記包括熱激轉導和電擊轉化兩種不同的類型,并且熒光蛋白質粒導入細菌的技術一直在不斷完善之中[2],熒光蛋白無毒性,保持熒光時不影響生物體功能[3],已在生物學中有重要地位,廣泛應用在生物的研究[4],然而,熒光蛋白標記必然會有一定的難度和相對不穩定性,比如轉導不成功或者熒光顏色較暗等問題,但同時會促進動植物之間的轉基因效率和檢測基因的表達水平等[5],近年來,熒光蛋白標記已經是分子標記研究中的一個熱點領域,并且逐漸形成了較為穩定成熟的標記方法。
熒光蛋白主要包括綠色、黃色和紅色3種顏色,綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)最初從水母(Scyphozoa)中分離,Matz等[6]從不發光的海洋生物群克隆到了GFP 基因,可在細菌、真菌、植物、動物中廣譜表達產生綠色熒光[7],黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)最初來自維多利亞多管水母(Aequoria victoria),發射波長為527nm,是 GFP的一種突變體[8],紅色熒光蛋白(redfluorescentprotein,RFP)最初從珊瑚中分離,發射波長為583nm,是 GFP的同源熒光蛋白[6,9]。熒光蛋白標記技術可以充分利用不同顏色的熒光穩定特性,能快速標記且檢測簡單,并能穩定遺傳且有更佳的示蹤結果[10],本研究對國內外熒光蛋白標記進行了綜述,總結了現有的科研成果,分析研究熒光蛋白標記面臨的挑戰,同時對其應用研究進行了展望。

1 熒光蛋白標記的原理
不同顏色熒光蛋白的標記條件略有差異,但歸納起來,標記原理都大體一致,主要是利用熒光致發光的現象觀察,通過紫外線或 X射線照射,使得波長進入激發態,發出比入射光波長的出射光。熒光蛋白標記是利用大腸桿菌(Escherichiacoli)作為輔助菌載體,進行質粒重組,以達到基因定位、基因表達的目的。隨著標記技術的發展,打破了單一的單色標記,進行不同顏色熒光蛋白雙色或者多色標記,不同顏色的熒光蛋白標記的發展不一,例如綠色熒光蛋白標記,田濤等[11]在果蠅(Drosophilidae)、大腸桿菌等生物體內成功表達GFP 基因,GFP標記系統作為分子標記物的歷史不長,但如今越來越多的研究人員將其作為一種快速的研究工具。

2 熒光蛋白標記的主要內容
2.1 熒光蛋白標記的對象和類型
目前的研究發現大多數質粒標記都能與大腸桿菌結合,通過大腸桿菌的輔助作用得以實現標記,大腸桿菌遺傳背景較為清晰,是構造簡單的原核生物,比較容易培養,常將質粒通過轉化轉移到大腸桿菌,質粒為游離在大腸桿菌中細胞染色體外能自主復制的分子量較小的環狀 DNA 分子,通過熒光蛋白的標記,可以直接觀察菌株的遷移和定殖,為菌株的作用機制研究打下基礎。隨著分子生物技術的不斷發展,蛋白質粒能穩定的導入至細菌中[12],熒光蛋白在植物、動物、微生物中均有研究,都可被熒光蛋白通過輔助菌幫助標記,胡迎青等[13]研究證明利用分子生物學鑒定的體外重組表達質粒,在 PCR反應時對模板純度的要求不高,比較容易完成熒光蛋白的標記。
2.2 標記方式
國內外熒光蛋白標記的方式主要有轉化和轉導兩種,在研究中質粒都能成功與大腸桿菌結合,近期研究表明轉導更更穩定[14]。
2.2.1 轉導 更先研究發現的轉化現象是在細菌中吸收不同 DNA 基因型改變自身的基因型和表型[15],革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌均能進行自然轉化,轉導的過程一般包括感受態的出現、DNA 的結合和進入、
DNA 的整合3個階段,感受態提供吸取 DNA 的生理狀態,可用 Ca2+ 或 Mg2+ 誘導細胞產生感受態,轉導在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中研究時間較長較深入。
2.2.2 轉化 轉化是以噬菌體為介質,使供體菌的目的 DNA 轉移到受體菌內部的現象。轉化分為普遍性轉化和局限性轉化,在普遍性轉化中,任何供體的染色體均可轉移至受體細胞,而在局限性轉化中,被轉化的 DNA片段僅是一些靠近染色體溶源化位點的基因[16]。轉化的 DNA 位于噬菌體蛋白殼外,不易被水解較為穩定,大部分細菌均具有噬菌體,可進行轉化。目前,大腸桿菌在轉化中研究最多。
2.3 標記條件
熒光標記需輔助菌的參與,方能進行 DNA 的轉移,由于熒光蛋白發光團無物種專一性,且不依靠任何介質發光,所以轉入宿主細胞的熒光蛋白基因很穩定,并對大多數宿主細胞無影響,能顯示單個或多個基因的表達情況[17]。
2.4 檢測方法
目前,常用檢測熒光標記的方法有以下6種:1)用手提藍光或長波紫外燈直接在黑暗環境下照射菌落或者菌液,可肉眼直觀地觀察出標記菌發出的熒光,進行快速的平板計數并做記錄。2)具有適當濾光片的熒光顯微鏡,被檢測菌落規范的放于載玻片,可觀察到單個標記菌體并在相應軟件保存照片計數記錄。由 Omega公司開發的Openlab圖像處理軟件可對圖像進行必要的處理[17]。3)以激發光為氬原子488nm 激光的共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal lasers canning microscope),能快速準確的分析熒光標記菌在生物膜中的空間定位,具有高分辨率及三維成像的主要功能[18],為比較實用理想的熒光檢測儀。4)使用流式細胞儀快速計算熒光標記菌數量及熒光強度,能對熒光細胞進行定性和定量分析,具有速度快、準確性好和精度高等特點[19]。5)雙光子激光掃描顯微鏡克服了普通熒光顯微鏡及 CLSM(激光共聚焦掃描顯微methods confocal lasers canning microscope)的光漂泊現象,能長時間對熒光標記菌進行分析與追蹤[20-22]。6)根據熒光標記菌的序列大小使用分子雜交、PCR 檢測和基因探針等分子生物學的方法進行檢測。

在熒光檢測中,背景熒光會直接影響熒光信號的強弱。在植物中,影響熒光信號檢測的自發熒光源主要是葉綠體和細胞壁[23],可通過減少進光量或者轉換合適的濾光片來解決。Smith[24]認為在檢測熒光基因材料時,熒
光信號與背景信號的比值較大的容易得到比較清晰的圖像。

3 熒光蛋白標記的研究方法
熒光蛋白標記是檢測和示蹤侵染最直觀、且易于操作的方法[25],不同的熒光蛋白標記方法各有優缺,使用的標準原因各異,但歸納起來,熒光蛋白標記的研究方法主要有以下兩種。
3.1 熱激轉導
熱激轉導是利用溫度水熱變化導致質粒之間的轉移接合,需要感受態細胞的參與才能順利進行,具體方法操作較為復雜[26]。熱激轉導的方法較為傳統,便于控制,試驗耗費較低,但國內具有轉導所需的所有設備,是一種實驗室經過高溫變化混合沉淀的過程,實驗室的研究大多數皆采用傳統熱激轉化的方法。通過熱激轉導,眾多研究學者均能較直觀的跟蹤目的基因,不斷優化轉導條件,李翠等[27]指出熱激蛋白和熱激轉錄因子在熱激轉化和耐熱性的產生過程中發揮了極其重要的作用。培養大腸桿菌的最適溫度為37 ℃水浴5min,大腸桿菌感受態細胞更大轉化效率的溫度為4 ℃保存18h[28],韓穎等[29]利用熱激法,用大腸桿菌輔助成功構建關鍵酶基因載體。孫彥等[30]成功利用熱激轉化構建白穎苔草(Carexrigescens)轉錄因子的真核表達載體。

3.2 電擊轉化
電擊轉化是通過電擊儀設定1700V 電壓和藥劑誘導進行質粒之間的轉化,具體操作方法需要特定設置[31]。電擊轉化因其需要特定耗費較高的實驗器材,轉化時間較短不易掌握,該方法在植物中的研究甚少,而在昆蟲動
物等方面研究比較廣泛[32],其原理為通過高溫脅迫改變酶活性及蛋白的穩定,使質粒能在輔助菌的作用下表達和利用。

4 應用
近幾十年,熒光蛋白在植物和微生物中的應用發展很快,熒光蛋白作為報告基因的特殊性,解決了許多研究中的難題。
4.1 熒光蛋白作為報告基因
熒光蛋白作為報告基因能直接有效的監測基因轉移的效率,無須底物的參與。程在全等[33]用構建的含有編碼綠色熒光蛋白的質粒,轉入到水稻(Oryzas ativa)愈傷組織,60d后取葉片成功分析了綠色熒光蛋白的表達。
Chiu等[34]用突變型GFP(S65T)基因轉化煙草(Nicotiana tabacum)葉肉組織和擬南芥(Arabidopsis thaliana)得到成功。Más等[35]、Jach等[36]用 DsRED 作為植物報告基因對煙草進行試驗,發現 DsRED 對植物的生長發育無負面影響,孫金鈺等[8]的研究為 YFP在生物學領域的廣泛應用提供充足的原料來源。其中,綠色熒光蛋白因其研究較深容易檢測,在各轉化中為常用的報告基因。
4.2 熒光蛋白作為追蹤標記基因
熒光蛋白通常分子量較小,能與多種不同的蛋白質端融合且不破壞原始蛋白特性,故熒光蛋白是一種直觀性很強的遺傳標記物,能特異地對植物細胞器進行定位。Kohler等[37]的研究發現綠色熒光蛋白可以直接觀察到植
物發育過程細胞的數目、分配和運動,GFP還能研究高等植物細胞器之間的分子交換。還有應用較廣泛的綠色熒光蛋白亞細胞標記物,構建 GFP和內質網定位信號 KDEL(key developed element length)的融合蛋白,結果觀察到轉化內質網膜質皮層的網狀結構[38]。
4.3 熒光蛋白在生物防治中的應用
目前生物農藥的殺蟲效果并沒有準確的評估,Chao等[39]通過觀察 GFP標記AcNPV 的熒光表達,可以準確地評估殺蟲劑作用下害蟲個體變化,為土地資源的更優利用有很重要的意義和應用價值。王延松等[40]運用農桿
菌介導法獲得 GFP標記菌株,研究病原菌與新疆大棗(Ziziphuszizyphus)的互作,直觀觀察病原菌在寄主體內的侵染過程。鄒曉威等[41]通過構建玉米絲黑穗菌(Sphacelothecareiliana)熒光標記菌株,分析及預防致病相關基因。
4.4 熒光蛋白在微生物領域的應用
利用熒光蛋白來標記根際微生物及代謝物,可直觀的追蹤和觀察出根際微生物的定殖、分布及其變化規律,確定根際微生物與植物的相互作用,有利于促進優良固氮菌、溶磷菌和生防菌的開發利用和推廣應用。利用熒光
蛋白檢測方便,可對活細胞進行實時動態的追蹤,在微生物領域是一種比其他檢測方法更有優勢的定殖方法。殷幼平等[42]利用 GFP標記枯草芽孢桿菌生防菌株 CQBS03在柑橘(Citrusreticulata)葉片上的定殖規律,研究得出該工程菌株能在柑橘葉片定殖,且接種42d后仍能檢測到工程菌,并對柑橘潰腸菌(Xanthomonascitrisubsp.)有生防作用,與原始菌株并無明顯差異。

5 研究不足及思路
熒光蛋白基礎理論研究不足。熒光蛋白獨特的發光特性給研究帶來了新進展,同時也是一種挑戰。采用熒光蛋白標記技術研究受體菌或者定殖時,首先面臨的一個挑戰就是對熒光蛋白基礎理論的深度研究,這樣才能有
效合理的利用熒光蛋白的特性。目前,國外已對綠色熒光蛋白的研究技術相對成熟,在細胞中能夠定位,作為標記蛋白保持熒光的同時不影響目標蛋白的活性,在生物體內也能表達不影響生物體的功能[3]。但是,不同顏色的熒光蛋白轉化條件和熒光特性各異,不同顏色熒光蛋白之間的通用性較差。國內在研究熒光蛋白時,熒光蛋白基礎理論研究未能趕上應用的速度,目前還存在若干問題,除綠色熒光蛋白[43]外的其他顏色還未能熟悉應用,進而阻礙了雙色標記或多色標記的后期研究。
楊曉玫1,姚拓1,2* ,師尚禮1,2(1.甘肅農業大學草業學院,草業生態系統教育部重點實驗室,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省草業工程實驗室,中-美草地畜牧業可持續發展研究中心,甘肅 蘭州 730070)
熒光蛋白的熒光時效性短。研究者建議檢測熒光強度時不得用過長的時間,這就需要增加檢測的靈敏度。因為靈敏度越高,熒光強度越強,檢測的時間也就越快速,信號轉導的越充分。但是靈敏度則與熒光蛋白的基礎有頗大的關系,綠色熒光蛋白的光譜較短,靈敏度較好,而其他顏色熒光蛋白靈敏度較差,時效性較短,熒光強度弱,這些都為熒光蛋白標記和轉化研究帶來了挑戰。雖然目前尚無直接證據證明紅色熒光蛋白和黃色熒光蛋白相比綠色熒光蛋白各功能較差,但對植物標記的轉化率的影響還是客觀存在的[44]。還有,熒光的個體數量龐大不一,只能判斷熒光的有無,而難以對熒光數量用于統計學分析。這些都是影響到熒光蛋白在標記研究中的應用。

分子生物學研究的挑戰。盡管分子生物學技術近年來在遺傳多樣性研究和功能基因多樣性中發揮了重要的作用,但國內外文獻報道主要集中在熒光蛋白的應用[45-46],而對熒光蛋白本身的功能多樣性和遺傳動態的研究
報道不是很多[47]。制約因素主要是試驗成本高、技術應用存在局限性、操作過程對試驗技術的要求較高[48]等,使得對于熒光蛋白的功能多樣性研究的方法很少。其次,分子標記技術的興起,熟練有目的的利用計算機軟件和網絡信息對數據的合理分析處理也將成為一項挑戰。最后,僅依靠分子生物學技術還不能全面透徹地解決熒光蛋白的發光標記機理等[49]問題,應與其他方法結合從而促進熒光蛋白研究的發展。

6 展望
熒光蛋白是研究生物細胞遺傳等生物現象的標記基因。我國學者已經認識到熒光蛋白研究的重要性,主要集中在綠色熒光蛋白的報告基因、生物傳感器、檢測pH 及離子等[50]。這些研究主要集中在已報道出的熒光蛋白等方面,并沒有研究其新型突變體熒光蛋白的標記效果。熒光蛋白檢測的熒光強度非線性性質是否有直接影響;新生熒光蛋白要通過折疊和加工才具有活性形式,過程的可獲得性較低;紫外激發對一些熒光蛋白有光漂白
和光破壞的不良影響;多數生物有自發熒光的現象,是否干擾熒光蛋白的正常檢測等,都是影響熒光蛋白標記成功的關鍵。當前人們對熒光蛋白結構功能的理解比在過去有了很大的提高,但仍有很多謎團和爭議急需解決。在現有知識的基礎上,可設計和改進已得到新型突變體熒光蛋白[51]。目前已有一些對熒光蛋白激發態的理論研究,但仍要努力闡明發射熒光的調節機制。
熒光蛋白研究由于其分子探針和標記基因的特性,難于直接肉眼觀察而面臨很多的挑戰。但是隨著科學技術的發展,將分子生物學和熒光蛋白有效的結合,已經應用到眾多植物之中[52]。熒光蛋白標記早在20世紀90年代就被應用到低等植物研究中,隨著熒光蛋白的顏色和突變型熒光的增多,國外已用紅色熒光蛋白和黃色熒光蛋白成功研究其根系的定殖等內容。分子生物學技術[53-56]的發展為熒光蛋白的報告作用提供了新的研究手段,對于熒光蛋白的研究不僅是理性工程,也要將隨機誘變和高通量篩選技術相結合以達到熒光蛋白分子有效進化的目的。可通過一些新的克隆或者突變來不斷拓寬研究內容,對優良突變體結構進行分析可以確定引起熒光蛋白性質變化的準確位點。因此,將分子生物學技術和熒光蛋白基礎研究相結合,可以為熒光蛋白標記作用研究提供很好的研究思路。
熒光蛋白作為當代生物科技研究中最重要的工具之一[57],可時空監測生物體內的基因表達、蛋白質定位、細胞內轉運途徑等生物現象,用于檢測熒光的熒光顯微鏡也在不斷進化硬件和軟件的功能[58],研究學者利用熒光顯微鏡清晰觀察釀酒酵母(saccharomyce)GFP和 RFP標記定位的目標蛋白[9]。近年來,熒光蛋白工程和熒光基因工程的迅速發展,使其隨著基因工程技術和細胞工程技術的日益成熟,產生更大的應用價值。但是,熒光蛋白是受轉化條件的制約,還是受自身條件資源限制,并無系統研究。若能深入了解熒光蛋白發光機理,標記條件與自身資源的關系、熒光蛋白的廣用性、不同熒光蛋白的適用結構,就能相應的采取適用顏色的熒光有針對性地進行定位研究,對指導熒光蛋白的精準定位具有重要意義。

論文原文下載：

熒光蛋白標記研究進展.pdf

文獻作者：楊曉玫1, 姚拓1,2,*, 師尚禮1,2
1.甘肅農業大學草業學院,草業生態系統教育部重點實驗室,甘肅 蘭州 730070;
2.甘肅省草業工程實驗室,中-美草地畜牧業可持續發展研究中心,甘肅 蘭州 730070