轉基因小鼠的報告基因如何選擇？
在研發(fā)轉基因小鼠或基因嵌入報告基因模式小鼠的過程中，經(jīng)常要用到報告基因。常用的報告基因包括：lacZ、EGFP、zsGreen、EYFP、DsRed (DsRed2)、mRFP、mCherry、HuCD2、Thy1.1、HA tag、FLAG tag、Luciferase等。那什么時候選擇哪種reporter呢?
做小鼠胚胎發(fā)育的研究人員一般喜歡用LacZ，也就是將LacZ置于一個啟動子的調(diào)節(jié)之下。用LacZ可以進行胚胎全身染色(whole body staining)，這樣可以了解一個基因在體內(nèi)的表達譜全貌。如果做細胞跟蹤，比如免疫細胞，神經(jīng)細胞等，一般喜歡用熒光蛋白。這樣一是容易對細胞進行分離(比如FACS)和體外分析，二是容易對分離的細胞進行體內(nèi)追蹤(比如Adoptive transfer)。早些年用的最多的是EGFP和EYFP。有的時候，我們需要將兩種不同的reporter小鼠交配在一起，研究兩個基因的關系，這時可以將兩個基因采用不同的熒光蛋白進行標記，也就是做兩種不同的模式小鼠。因為早期大家多是用EGFP，現(xiàn)在可以多做一些其它熒光蛋白的報告基因小鼠，以便跟以前研發(fā)的EGFP小鼠結合起來研究。 zsGreen和EGFP, EYFP都是綠色熒光。EGFP和EYFP很難區(qū)分開。zsGreen是一個比較穩(wěn)定的綠色熒光蛋白。DsRed和TdTomato都是紅色熒光。這兩種熒光蛋白都有報告基因模式小鼠發(fā)表。TdTomato是一個信號非常強的熒光蛋白，目前已經(jīng)有報告基因小鼠發(fā)表，對細胞/小鼠也沒有明顯的毒性。相信以后會有越來越多的小鼠用TdTomato來做報告基因。雖然mRFP和mCherry是兩個非常好的熒光蛋白，但由于它們需要584nm的激發(fā)光，所以一般的FACS儀器不能檢測到信號，需要用到LSRII這樣的儀器，而很多實驗室可能沒有這樣的儀器。也有用EBFP, ECFP做細胞實驗的，但用到小鼠上的比較少。比如需要用到紫外光來激發(fā)。如果想在一個小鼠里表達兩種熒光蛋白，更好是用兩種分得比較開的，比如，更好不要同時用EGFP和EYFP。
HuCD2和Thy1.1是細胞表面受體。HuCD2因為去掉了C-term序列，使得其失去了信號傳導的功能。那什么時候會用這兩種分子呢?比如我們想研究一個細胞內(nèi)蛋白基因(比如轉錄因子)的功能，經(jīng)常需要把表達這個蛋白的細胞分離純化出來。這個時候可以將HuCD2或Thy1.1報告基因放置在這個細胞內(nèi)蛋白基因啟動子下(比如加一個IRES-Thy1.1), 這樣所有表達這個細胞內(nèi)蛋白的細胞都會在細胞表面表達Thy1.1。這樣就可以用anti-Thy1.1抗體將這一群細胞分離出來，進行后續(xù)研究。當然也可以用anti-Thy1.1抗體進行組織切片的免疫熒光檢測。
HA、FLAG、Biotin等是細胞和生化實驗中常用的標簽多肽或蛋白。在western blot，免疫沉淀(Immunoprecipitation)等實驗中經(jīng)常用到，因為有非常特異的HA、Flag抗體。Biotin可以跟生物素(Streptavidin)直接結合并用于免疫沉淀。在模式小鼠中，這些標簽多肽或蛋白可以與要研究的蛋白做成融合蛋白。這種模式小鼠最常被用到的是Chip-chip實驗。比如要研究一個轉錄因子的功能，就需要知道這個轉錄因子在細胞內(nèi)(正?；虼碳l件下)結合到染色體基因組DNA的位置以及結合序列。我們知道，特異性好、親和力高的抗轉錄因子的抗體非常不容易得到或制備。這個時候可以將標簽多肽(比如FLAG)放在轉錄因子的C-term，做成融合蛋白。刺激細胞之后，對細胞進行化學交聯(lián)，并破碎細胞以及基因組DNA，然后用anti-FLAG抗體作免疫沉淀，將轉錄因子沉淀下來。最后分析這些轉錄因子所結合的DNA片段序列，從而找到該轉錄因子的在基因組上的識別序列，也就找到了該轉錄因子的作用基因。
熒光素酶做報告基因模式小鼠，一般是為了做活體成像實驗。比如在一個細胞因子啟動子下面放置熒光素酶基因。免疫小鼠之后，有些細胞或器官表達該細胞因子同時表達熒光素酶。通過注射熒光素酶底物可以檢測熒光在小鼠體內(nèi)的分布，從而得出該細胞因子在不同免疫條件下的表達情況。熒光素酶在癌癥研究中也經(jīng)常用。通過熒光活體成像可以研究腫瘤細胞的發(fā)生和轉移。報告基因很多。這里只是一點簡要的介紹。不同的模式小鼠根據(jù)實驗目的不同，可以做非常不同的設計。

小鼠胚胎移植5個實用方法：
小鼠胚胎移植，即通過體外受精或其他方式得到的胚胎移植到假孕受體，使胚胎在體內(nèi)發(fā)育并生崽。由于胚胎移植后能在固定的時間內(nèi)得到大量的后代，并能提升一定的微生物等級，所以目前該技術在多方面得到運用：生物凈化、輔助生殖、快速擴繁等。而今天我就給大家就小鼠胚胎移植方面相關的實驗操作，提供一些能讓我們的工作變得更加快捷與方便的小技巧；也嘮叨一些可以使我們的操作更規(guī)范的小“麻煩”。
1、實驗后的假孕受體的快速區(qū)分：我們進行移植的受體品系一般都是一個品系且體重范圍固定，但是胚胎卻有多種品系，移植胚胎后的受體從外觀上基本無法區(qū)分。我們目前推薦的方法是在小鼠耳朵和尾巴上用馬克筆直接做標記，標記大概能保持12小時，待移植結束，小鼠蘇醒前都不會消失，后面就可以直接上架用籠牌區(qū)分即可。該方法的好處就是方便快捷，比打耳標或剪耳更人性化，沒有痛苦，減少動物的傷害，讓受體能安心懷孕待產(chǎn)，快樂的做鼠媽媽！
2、減少人為的污染：在移植時，使用口吸管操作既可以靈活控制氣流，又可完成大批量的胚胎操作，所以目前我們選用口吸管來進行胚胎移植，前期我們移植時都是摘下口罩后再用口吸管操作，但是人的口腔是含多種細菌的，很有可能就在你摘下口罩的那一刻把病菌散播到空氣當中，污染設施。我們就考慮是否可以通過減少暴露面積，來達到減少污染的目的。后面我們移植采用的都是不摘口罩，口吸管直接從口罩下方進入操作，基本上可以達到口罩擋住口腔，并且不影響移植，這樣環(huán)境清潔度我們也維持住了，實驗也能照常進行，何樂而不為？
3、節(jié)省移卵針的使用：我們每天可能會進行多個品系的移植操作，無論是清洗胚胎還是移植胚胎，都要用到移卵針。而為了保證每個品系胚胎不混淆，也保證胚胎微生物等級不互串，我們現(xiàn)在要求一個品系操作完換下一個品系前都需要換針，防止移卵針內(nèi)有胚胎遺留而造成品系混淆、微生物等級互竄。所以每天我們都需要使用很大數(shù)量的移卵針，不停換針也很浪費時間。為此我們想到一個好辦法，就是直接在移卵針上提前寫好品系編號，這樣在操作相應品系時就用該品系編號的針，基本上移卵針就比原來的用量減少了一半，也防止了品系混淆，省心又省力。
4、快速疏通移卵針：移植時，總會遇到一個情況，針頭被堵了，胚胎吸不上來，移植也不順暢，正常情況下我們都會選擇換一根針，但是如果是操作不好的新人，估計換了很快又會堵了，就要換N根針了，很浪費！其實有個方法只需要1S就能解決針堵的情況，就是把針頭放到打火機的火焰上輕輕一燎，堵住針頭的組織就被燒成二氧化碳和水蒸氣了，而且還做了一次高溫消毒，效果非常好，減少了換針的時間，也減少了浪費，不過燎了也不好使的話還是換針吧！
5、巧修顯微鑷：移植的顯微鑷十分嬌弱，在不使用的時候我們通常都會用保護套將鑷子尖頭處護住，但是還是會有不小心將鑷子尖頭弄彎弄歪的情況，這個時候顯微鑷基本就不能使用了，因為在顯微鏡下都是微量操作，稍微彎了或歪了，根本夾不住輸卵管或子宮了，這種顯微鑷基本就被淘汰了。其實這時候我們還是有可能把它挽救回來的，方法就是用持針鉗對顯微鑷的尖頭進行微調(diào)，并在顯微鏡下看是否調(diào)回可用狀態(tài)，反復幾次，可能就又可以使用了！
其實我想，應該不止是小鼠胚胎移植，大家在實驗操作中肯定都會領悟一套自己的小技巧，讓自己的工作更輕松，又不違反Sop操作要求，甚至可以更好的維護Sop的要求。而以上就是我們發(fā)現(xiàn)的一些小小的方便點，可能算不上特別高大上，也或有不足的地方希望能得到大家指正，當然如果大家覺得真的有用的話就趕緊試試吧！

小鼠在生物基因研究的應用
小鼠由于體形小，易于控制，生長繁殖快，且飼養(yǎng)管理方便，又有明確的質(zhì)量標準，已培育成大量的近交系、封閉群和基因突變動物。其近交系有500多個，突變系有410多種，遠交群有200多種，因此在生物醫(yī)學研究的各個領域得到廣泛應用?，F(xiàn)將小鼠在生物醫(yī)學領域的應用作一簡要概述。
(一)藥物評價和毒性試驗
1．藥物急性毒性試驗測定  藥物或化學制劑的半數(shù)致死量及“三致”(致畸、致癌、致突變)試驗，小鼠是最合適的動物。
2．生物藥品和制劑的效價測定  小鼠廣泛用于血清、疫苗等生物制品的檢定，如百日咳菌苗、乙肝疫苗等。激素效價的測定，如利用小鼠子宮增重測定人絨毛膜促性腺激素的生物效價。
3．藥物篩選試驗  小鼠常用于藥物對疾病療效篩選試驗，如抗腫瘤藥物、抗結核藥物、抗瘧疾藥物等的篩選。
4．用于某些藥物藥效和副作用的評價  如利用小鼠瞳孔放大作用測試藥物對副交感神經(jīng)的影響；用聲源性驚厥的小鼠評價抗痙攣藥物；用小鼠熱板技術引起的后爪運動或機械壓尾評價止痛藥的效果；用Termorine羥基衍生物誘發(fā)小鼠發(fā)抖模型來評價抗顫抖藥物的作用(如帕金森病不自覺的顫抖)；用小鼠角膜和耳郭反射評價鎮(zhèn)靜藥藥效。小鼠還用于全身麻醉藥的測試和評價。
(二)腫瘤學研究
腫瘤遺傳學的研究進展很快，小鼠已成為研究中的主要材料，用于腫瘤病毒基因組學說和癌基因假說的研究，用于小鼠乳腺癌、垂體腫瘤、腎上腺皮質(zhì)腫瘤發(fā)生過程中基因成分的相互作用的研究。這些小鼠的自發(fā)性腫瘤從腫瘤發(fā)生學上來看，與人體腫瘤較為接近，用其作為治療藥物的篩選可能更理想。自發(fā)性腫瘤多為病毒性，如A系小鼠出生后18個月內(nèi)有90％的肺癌發(fā)生率，C3H小鼠乳腺癌發(fā)病率達97％。同時，小鼠對致癌物質(zhì)敏感，可誘發(fā)各種腫瘤，如二乙基亞硝胺可誘發(fā)小鼠肺癌、甲基膽蒽可誘發(fā)小鼠胃癌和宮頸癌等，是研究人類腫瘤極好的模型。另外，嚴重免疫缺陷小鼠，如裸鼠、SCID小鼠可接受各種人類腫瘤細胞的植入，直接用于人類腫瘤生長、轉移及治療的研究。
(三)傳染性疾病研究
因小鼠對多種病原體敏感，易感染，常用于研究這些病原體的發(fā)病機制、臨床癥狀及治療。常用小鼠對沙門菌病、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎、狂犬病、血吸蟲病、瘧疾、破傷風、脊髓灰質(zhì)炎和鉤端螺旋體病等人和小鼠共患性疾病進行研究，如病原體的致病力、宿主抗病機制、病理過程和治療學等方面的研究。
(四)遺傳學和遺傳性疾病的研究
小鼠毛色變化多樣，其遺傳學基礎已研究得比較清楚，因此常用小鼠毛色做遺傳學分析。重組近交系用于研究基因定位及其連鎖關系。同源近交系用來研究多態(tài)性基因位點的多效性、基因的效應和功能以及發(fā)現(xiàn)新的等位基因。此外，許多小鼠具有遺傳性疾病，如小鼠黑色素病、白化病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、家族性肥胖、遺傳性貧血、尿崩癥等。這些疾病與人類發(fā)病相似，可用做人類遺傳疾病的動物模型?；蚬こ碳夹g發(fā)展，促進了對轉基因的動物研究。現(xiàn)在，借助轉基因小鼠對基因功能、表達和調(diào)節(jié)，探索疾病的分子遺傳學基礎和基因治療的可能性和方法的研究引起了生物醫(yī)學界的高度重視。
(五)老年病學的研究
老年學研究的是人類老化現(xiàn)象的起因和機制，期望控制老化，達到延年益壽的目的。小鼠壽命短，傳代時間短，隨著鼠齡的增加，機體內(nèi)的一些生理、生化指標不斷發(fā)生變化，特別是高齡鼠中老年病明顯增多，是老年學研究的極好材料。多用于糖質(zhì)、脂質(zhì)、膠原和免疫等方面的研究。
(六)計劃生育研究
小鼠繁殖力強，性周期和妊娠期短，生長快，適合計劃生育研究。如常用小鼠做抗生育、抗著床、抗早孕、抗排卵等實驗應用的動物。
(七)免疫學研究
小鼠對特異性抗原的免疫反應受遺傳控制。其體內(nèi)控制免疫反應的基因決定著對各種疾病的易感性，決定著自身免疫病和體液免疫反應。BALB/c、C57BL/6J等小鼠常用于單克隆抗體的制備和研究，免疫缺陷小鼠可用于免疫機制的研究。
(八)微生物學和寄生蟲學研究
因小鼠對多種病原體具有易感性，因此通常用它來研究微生物及寄生蟲對機體的感染途徑、發(fā)病機制及綜合防治。此外，小鼠還可用于內(nèi)分泌、呼吸和消化等系統(tǒng)疾病的研究。